药学专业毕业论文外文翻译--通过合成氟代嘧啶核苷竞争性抑制人多聚(A)特异性核糖核酸酶(PARN)

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1、PDF外文：http:/ 8900 字  出处： Balatsos N A A, Dimitrios V, Panagiotis M, et al. Competitive inhibition of human poly(A)-specific ribonuclease (PARN) by synthetic fluoro-pyranosyl nucleosides.J. Biochemistry, 2009, 48(26):6044-51. 本科毕业论文 (设计 )外文翻译   译文：  通过合成氟 代嘧啶 核苷 竞争性抑制人 多 聚 (A)特异 性核糖核酸酶

2、 (PARN)  Competitive Inhibition of Human Poly (A)-Specific Ribonuclease (PARN) by Synthetic Fluoro-Pyranosyl Nucleosides  摘要 ： 聚 （ A） 特异性核糖核酸酶 （ PARN)是一种获 得性 相互影响的 脱腺苷 ，这个 脱腺苷酶 是 居间 的， 和其它外切核酸酶类连接在一起 ， 参与 真核信使 RNA 的翻译表达 ， 因而它能积极参与有规律的基因的表达。 到目前 为止， 氨基糖苷类和自然核苷酸是唯一报道的人类 PARN 活动的 调节 器。在现在的研究中

3、， 我们 发现 合成的核苷类似物连接一个 氟代嘧啶 核苷 的 糖基和苯甲酰修饰的胞嘧啶或腺嘌呤 作为基本官能团 能有效地抑制人类 PARN。 如以前所报道，当对多种肿瘤细胞系进行测试时，这种核苷类似物表现出很大的抑制作用。 动力学分析表明，对PARN 的抑制是有竞争 性的， 并不能通过改变 外切核糖核酸酶类 镁 （ ） 的浓度来释放。此外，用乙酰和 /或糖基三苯甲基来替代糖基上 2， 4或 6的 OH 是抑制效果的关键。 要了解核苷如何准确的进入 PARN 活性部位，通过分子动力学模拟之后我们对分子进行对接。在硅片分析表明，这些化合物能有 效地进入 PARN 活性中心。我们的研究结果支持这一想

4、法即通过起 催化作用的氨基酸残基的相互作用使 糖基介导的稳定的核苷到达活跃的部位。 两者合计，在体外和硅片的数据表明，我们人类 PARN 分子之间的目标是通过降低 信使 RNM 的周转率 而使 这些化合物可发挥治疗作用，从而解释其在分子 水平上 的 已知的体内抑制作用。      脱腺苷化 是镁 （ ） 依赖的 外切核糖核酸酶类 ，它可以不断裂解 多 聚 （ A）的末端，并释放 5平滑肌磷酸酶 1。 在所有的 脱腺苷 ， 聚 （ A） 特异性核糖核酸酶 （ PARN）  是独一无二的，因为它可以 在脱腺苷化期间 与 5帽结构 和 多 聚 （ A）的末端

5、相互作用  2-5。 这种酶同时位于真核细胞的细胞核和细胞质中 6。 生化研究表明， 尽管没有在一个酶截断形式的晶体结构中发现这种离子 ， 镁 （ ） 离子对催化作用是必要的 7-8。 PARN 活动是通过辅助蛋白因子及与 5帽结构的 相互作用来进行体外调控的研究 3， 9-16。 PARN 是真核生物 mRNA 翻转 时 重要的 介质 ，并在部分基因的表达方面起调节作用。 尤其是当细胞增殖异常，需要向上调节翻译水平和回收 mRNA， PARN 可能是一个潜在的目标分子化合物用来抑制这些过程的速度。 这里有一些报道关于 PARN 抑 制因素 可以调节酶的活性。 据了解人类PARN 可

6、以被氨基糖苷类抑制，其中该化合物可以使活性部位变异 和 /或取代的重要的二价离子的功能，如二价镁 （ ） 离子。 氨基糖苷类抗生素被广泛的应用于临床实践中 而且 这些抗生素治疗期间展出的毒性的副作用可以被这些抑制剂所解释 17。 此外，它还已经证明， 天然的 嘌呤核苷酸也可以抑制 PARN 的活性 18-19。更具体地说，我们先前已经表明 RTP 的核苷酸来抑制酶是非竞争性的， 而 RDP和 RMP 的行为是竞争性的 19。  核苷类似物已被广泛用于防治癌症和病毒感染 20。 一个设计新颖的共同 战略 核苷类似物是糖基修饰。 例如， 阿糖胞苷和吉西他滨是糖修饰胞嘧啶类似物。阿糖胞苷抑

7、制 DNA 聚合，并已用于急性髓细胞白血病的临床治疗 21，而吉西他滨 （ dFdC） 轴承氟改性糖最初设计是作为一种抗病毒药剂已被证明能够抑制 DNA的合成， 核糖核酸还原酶，并将其纳入核糖核酸 22-23。 此外，一些核苷类似物是RNA 病毒引起的疾病的一线治疗药物 24-25。 所有这些化合物 是主要的内源性代谢 核苷酸和核苷，和活性代谢物的目标之一或更多的酶，如 DNA 和 RNA 聚合酶。核糖核酸酶活动也可以是潜在的分子靶标用于核苷类似物抑制 。这就是艾滋病毒 RNA 依赖的 DNA 聚合酶的核糖核酸酶 H 域的案件 26-28。  近年来，携带一个 六元 碳水化物部分的

8、核苷类似物如 ketonucleosides， 已被评估他们的抗癌和抗病毒的潜力 29-32。 此外，糖环上添加一个氟原子和在这基础上再添加一个 苯甲酰基以 提高类似物的生物活性（档号 31和参考文献）。然而，到目前为止这些化合物没有分子靶点或他们的合成中间体已经被确定。 上述工作，促使我们学习作为一个潜在的人类 PARN 分子目标等核苷类似物抑制。 我们侧重于这种酶的活性被天然的核苷酸减弱， 其结构是已知的重 大影响，它展示了主要 脱腺苷化在 动物体内。 我们证明 PARN 可以有效地抑制 由几个核苷类似物轴承六员氟改性糖基带或不带底座上苯甲酰组（腺嘌呤或胞嘧啶）。 我们发现，这些类似物表现

9、为 PARN 的 竞争性抑制剂， 更重要的是，增加镁（ II）离子的浓度不能恢复酶的活动。 为了支持我们的生化数据，我们在分子动力学 （ MD）的模拟之后进行分子对接实验， 我们预测核苷的对接构象可以进入活动现场。 生化和在硅片 的三维模型分析显示这三个糖羟基在高效抑制作用方面是重要的角色。 我们的数据表明， 在本研究中所使用的类似物铅化合物可作为服务于发展的新可能的 PARN抑 制剂和其他基本 deadenylases 与新的治疗方法的潜力用 。  材料与方法  材料   所有化学品包括嘌呤核苷酸和 脱氧核苷酸， 亚甲基蓝， polyadenylic 酸钾盐（平

10、均粒径 300 腺苷，巴士 A300）来自 SigmaAldrich. 核苷类似物的合成。 氟代嘧啶 核苷 合成如前所述 （ 31）。  简单地说，凝结 1， 2， 4， 6-四 - O -乙酰基 - 3-脱氧 -3-氟 -葡萄糖胞嘧啶， silyated N4-苯甲酰胞嘧啶，或 N6-苯甲酰腺嘌呤造成的 1 的生产 -（ 2， 4， 6三 -O-乙酰基 -3-脱氧 -3-氟 -D-吡喃葡萄糖 -N4-苯甲酰胞嘧啶 （ 5 条）或 9-（ 2， 4， 6三 -O-乙酰基 -3-脱氧 - 3-氟 -D-吡喃葡萄糖 ） - N6-苯甲酰（ 1）腺嘌呤 ， 分别来说 ， 在场的三甲基硅三氟

11、甲烷磺酸钠和锡氯化物 。脱保护的第 5 条与氢氧化钠乙醇吡啶格 A1 分别产生 1-（ 3， 4-脱氧 - 3-氟 -D-吡喃葡萄糖 ） 胞嘧啶（ C6）的 ， 1 -（ 34-脱氧 -3-氟 -D-吡喃葡萄糖 ） - N4-苯甲酰胞嘧啶 （ A6 的）， 或 9 -（ 3， 4-脱氧 -3-氟 -D-吡喃葡萄糖 ） -N6-苯甲酰基腺嘌呤 （ A2）的。 A2 的治疗和干 2， 2-二甲氧基丙烷， N， N-二甲基甲酰胺，通过乙酰化后的自由羟基集团在 2位的糖基醋酸酸酐 /吡啶，去除 异亚丙基 ，而且，最后，选择性保护的主要 6 -羟基组一组取得了三苯甲基化合物 A4。 氧化的氟 乙酰化 前

12、体 A4 与吡啶 踵铬酸盐 /乙酸酐 给予 9-（ 3-脱氧 -3-氟 -6-O 型三苯甲基-D-glycerohex-2-enopyranosyl-4 -ulose） - N6-苯甲酰基腺嘌呤（ A 3） 。   表达和纯化重组 PARN。  质粒编码的全尺寸 74 kDa 的 人类 PARN（ Virtanen教授提供的 ， UppsalaUniversity， 瑞典）（用于 N-末端 His6 标签的多肽表达），被传递 给 BL21（ DE3）细 胞去表达重组蛋白，如前所述 33，加入一些修改。 简单地说，菌落生长在 37 过夜的卡那霉素（ 50 ul/ml）。培养物

13、在 （ 1:100） 稀释后在相同的 37 被异丙基 -1-硫代 -的 D-半乳糖苷（ IPTG）诱导的一个最终的浓度0.1mm 的培养基中生长。用于 PARN 表达的培养液被允许在 37 下培养 3 小时。在 4 下经离心法收集细胞要 20 分钟， 和颗粒被冻结在 - 70 。 表达了他的标记可溶性蛋白进行纯化下列先前描述协议 33。  PARN 活性测定和动力学分析。 如所述前 34，酶的活性可以被亚甲蓝所测定。作为时间函数 脱腺苷酶 率被确定用时间进程分析 （ 图 1）。 亚甲蓝是由 1.2mg 的亚甲蓝溶解在 100ml 的 3-吗啉基丙磺酸缓冲液中制备而成的 （ 0.1m 的 3-吗啉基丙磺酸 -氢氧化钾， pH 值 7.5 和 2mmEDTA）。 标准反应缓冲液含 20mg 羟乙基哌嗪乙磺酸 -氢氧化钾（ pH 值 7.0） ， 1.5mg 氯化镁，氯化钾 100mg， 0.1ulRNA 酶，0.2mg 的乙二胺四乙酸， 0.25mg 的 DTT， 10% （ v/v）  的甘油， 0.075-0.6mg 聚（ A） 。  所有的核苷酸溶解在反应缓冲液后才能使用。 反应进行了利用0.01-0.02mm 的重组 PARN。  对于动力学分析，底物浓度 聚（ A）条 介于 0.075