1、中文 3800 字 文献出处： Kizaki N, Yasohara Y, Hasegawa J, et al. Synthesis of optically pure ethyl ( S )-4-chloro-3-hydroxybutanoate by, Escherichia coli, transformant cells coexpressing the carbonyl reductase and glucose dehydrogenase genesJ. Applied Microbiology & Biotechnology, 2001, 55(5):590. 由 共表达 碳酰
2、还原酶 和 葡萄糖脱氢酶 的 大肠杆菌 转化细胞 合成纯光学（ S） -4-氯 -3-羟基 丁酸乙酯 Kizaki N, Yasohara Y, Hasegawa J, et al. 1.摘要 本本篇文献研究了利用 COBE 不对称合成（ S） -4-氯 -3-羟基 丁酸乙酯 （ CHBE）。 大肠杆菌 细 胞作为 催化剂 同时表达了来自 念珠菌 属辛夷的碳酰 还原酶 和来自 巨大芽孢杆菌 的 葡萄糖脱氢酶 基因。在水 /有机溶剂 两相体系中， (S)-CHBE在有机相中的浓度可以达到 2.58M（ 430g/l），摩尔 产率 达到 85%。 大肠杆菌 的副产物 S1 和 GDH也达到了 1.
3、25M（ 208g/l），COBE 在水相中不稳定，所以 (S)-CHBE 可以在 水单 相中不停的生成。在这种情况下，适当的从 NADP+到 CHBE的转变达到了 21,600 mol/mol。所形成的 CHBE的 旋光度 在这种体系中 100%对映体 过量。在水相中用携带含有 S1 和 GDH基因 质粒 的 E. coli HB101 作为 催化剂 不对称还原是比较简单的。并且，这种体系并不额外需要商业 GDH或者 有机溶剂 。因此，这种体系对于实际合成纯 光学活性 的 (S)-CHBE是非常方便的。 介绍 具有 旋光性 的（ S） -4-氯 -3-羟基 丁酸乙酯 在 药物制剂 的合成中是
4、重要的 手性化合物 。其右旋体 是 L-卡尼汀 的前体，其 左旋体 是羟甲基戊二酰 辅酶 A还原 酶抑制剂 的起始材料。许多研究描述了以 面包酵母 为基础 微生物 或者酶的 COBE 的不对称还原。我们先前已经知道利用来自 念珠菌 属辛夷 AKU4643 细胞催化 COBE生成 光学纯度 96%的 CHBE。这种酵母至少有三种立体选择性的 还原酶 ，这种酵母产生的 CHBE并非纯光学的，在这三种酶之中，NADPH-依赖碳酰还原酶，我们克隆并 测序 编码 S1 的基因，并在大肠杆菌中过表达。大肠杆菌 转化细胞 在 葡萄糖 ， NADP+和 商业化 的 葡萄糖脱氢酶 作为 辅酶 因子的 启动子 催
5、化COBE生成纯光学的 CHBE。 我们构建这三种大肠杆菌 转化细胞 共表达 来自的 S1 和来自 巨大芽孢杆菌 的 GDH，并分析 COBE被这几种 菌株 催化还原的反应机理。先前的报道表明，利用 酶催化 还原 COBE生成 CHBE光学纯度 可达 92%，也提到了因为 底物 （ COBE）在水相中不稳定，并 且酶容易 钝化 ，所以利用酶或者 微生物 在 有机溶剂 /水两相体系中 催化反应 。我们研究了在 水单 相体系中由 COBE还原生成纯光学的 CHBE，还讨论了这种反应体系在工业应用中可能的用途。 2.材料和方法 2.1菌株 和 质粒 本次实验中使用的大肠杆菌是 JM109 and H
6、B101。来自 B. megaterium 的 GDH基因插入到 Pkk233-3 质粒 中，而带有 GDH基因片段 的 pGDA2 质粒由到由 大阪大学 的 urabe 教授提供。质粒 pSL301 和 pTrc99A 是由美国的 Invitrogen 公司和英国的公司分别购买的。质粒pUC19 和 pST28 是由日本 takara 公司购买的。 这次实验使用的 重组质粒 构建如下：质粒 pGDA2 被 EcoRI 和 PstI 双酶切 从而分离出一个大小约为 0.9kb 的包含有 GDH基因的 DNA片段。这个片段被插入到质粒构建 pNTS1是为了过表达前文所提到的 S1，这个 0.9kb 大小的片段被插入到 pNTS1的 EcoRI-SalI酶切位点 从而构建 pNTS1G。 Psl301的 EcoRI-PstI酶切位点 从而构建出质粒 pSLG。质粒 pSLG 被 EcoRI 和 XhoI 构建 pNTS1 是为了过表达前文所提到的 S1，这个 0.9kb 大小的片段被插入到 pNTS1 的 EcoRI-SalI 酶切位点 从而构建
