1、中文 5250字 出处： Newman A M, Bratman S V, To J, et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverageJ. Nature Medicine, 2014,20(5):548-554. 一种对大量病人的 循环肿瘤 DNA超灵敏定量检测方法 摘要 循环肿瘤 DNA（ ctDNA） 是一种在非侵入性肿瘤负担评估中极具前景的分子标记 ，然而现如今的 ctDNA 检测技术在敏感度或 病人覆盖率以及临床应用前景中存在不足。在此我
2、们推出一种 经济而高敏感度的 定量 ctDNA 的 技术 CAPP-Seq（肿瘤个性化深度测序档案）。我们在非小细胞肺癌（ NSCLC）患者中实施了 涵盖 95%肿瘤中确定突变的体细胞改变的多类别CAPP-Seq。我们发现在 100%的 II-IV 期 以及 50%的期 NSCLC患者 中发现 ctDNA，并且 96%的 等位基因 突变存在特异性 低至 0.02%的片段 。 ctDNA的水平与肿瘤体积 ，微小残留病灶以及治疗相关影像学改变之间存在 高度相关 性，因此 ctDNA 水平的测量比影像学能让我们更早的做出评估与对策。最后，我们 通过 CAPP-seq 评估 免 活检肿瘤筛查和基因分型
3、。我们设想， 应用 CAPP-sep 以检测和监测不同的恶性肿瘤可以作为常规 临床检测 ， 从而促进个性化癌症治疗 对 ctDNA的分析有颠覆当前对肿瘤的发现与监测的可能性。这种非侵入性获取肿瘤来源 DNA的方法在那些无法通过非侵入性手段对此取样 的实体肿瘤中非常受欢迎。在非小细胞肺癌中，已有基于 PCR技术的序列以用于发现血浆 DNA基因中的复发变异点例如 KRAS（鼠类肉瘤病毒癌基因）或 EGFR（表皮生长因子受体），然而大部分病人并没有在这些位点的变异情况。近来也有使用大规模平行测序来探测 ctDNA 的技术。然而这些报道的数据都体现了这些测序方法在敏感性上的不足，仅适用于一个较小的病人
4、群体，对病人都需要额外的最佳算法以及额外的开销。为了克服以上不足，我们设计了一种新的统计分析 ctDNA 的策略。我们的策略， CAPP-Seq，将优化大众低水平 DNA 基因库与多 相生物信息学技术结合，设计了一个由生物素化的 DNA 寡核苷酸构成的， 针对我们关注的肿瘤的循环变异区域的“筛选器”。为了监测 ctDNA， 选择器用于肿瘤基因鉴定，以确定病人的肿瘤特异性基因偏差，然后直接在 ctDNA 中进行定量。在这里，我们展示其技术性能并探索 CAPP-seq 在早期和晚期 NSCLC患者的效用。 结果 为 NSCLC所设计的 CAPP-Seq筛选器 在 CAPP-seq 实施初期 ，尽管
5、我们的方法是适用于任何 存在已被确定 的复发突变 的癌症， 我们着重关注 NSCLC。为了 设计一个非小细胞肺癌的 筛选器，我们开始从 COSMIC数据库 以及其他资源 中列入那些可能驱动复发突变的 基因的 外显子 。之后 ，利用 TCGA 中所收录的 407位 NSCLC 患者的 全基因组测序数据 ，我们应用一种迭代算法以最大化每个病人的错义突变数量而同时最小化筛选器的大小 大约 8%的 NSCLC 受体变异涉及受体酪氨酸激酶基因编码 ALK（间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶基因）， ROS1 基因（酪氨酸激酶 1）或 RET 原癌基因 17-21。 为了利用 在内外显子 固有的连接变异中特有的序
6、列的低错义率，我们涉及了内含子和外显子基因生成中的这些的反复融合断点以完成最后设计。为了 检测肿瘤组织和血浆 DNA 中的 基因融合 。 我们开发了一个 为了优化的超深覆盖率数据的 断点 测序 算法 ，该算法的所应用的下一代测序法（ NGS）通过两个非小细胞肺癌的数据从核苷酸层面将已知的细胞受体 基因融合 与 以前所识别到的未知断点。 总的来说，非小细胞肺癌的筛选器的设计覆盖 521个外显子和 13个内含子 139复发性突变基因，总覆盖 约 125 KB。 这个小目标区间中（人类基因组的 0.004%），筛选器能 得到 单核苷酸变异（ SNV） 的中位数为四， 并覆盖 96%例肺腺癌或鳞状细胞癌。 为了验证每个肿瘤的基因突变的数目，我们研究了从一个独 立的队列 183 例肺腺癌的 WES 数据的选择区域 。我们的筛选器覆盖了以 4 个 SNV 为中位数的 88%的病例，比从随机抽样的外显子组所预期的要多 4倍，从而验证我们筛选器所设计的算法。 方法优化与绩效评价 我们 通过 NSCLC 选择器 进行深度测序并 实现 约 10000覆盖（
