1、中文 6260 字 出处： Camilo P, Sabina G, Jrmy B, et al. Structure and mechanism of an active lipid-linked oligosaccharide flippase.J. Nature, 2015, 524(7566). 脂连接寡聚糖翻转酶的结构与催化机制 镶嵌在膜中的脂类 具有较大的极性头部基团，它们的翻转 过程 是缓慢的，并且极为不利的。因此，这一过程需要翻转酶来催化，但 其 催化机制却是未知的。一个关于翻转反应的著名例子是可在 蛋白质的 N-连接糖基化作为供体的脂连接寡聚糖的转位。 在空肠弯曲杆菌中，这一过
2、程是由 一种 ABC 转运体 PglK 催化的。 基于不同状态下的晶体结构，我们在此提出一个 由 PglK 催化的脂连接寡聚糖 的翻转机制。 在体外， PglK 能够运用内部和外部的构象， 但是只有外部的构象才是 催化 翻转 反应 所需要的。 当脂连接 寡聚糖链的焦磷酸 -寡聚糖链头部基团进入了转位腔后，会与周边肽链上的正电荷 发生相互作用； 而脂质的多聚异戊二烯尾则结 合并激活该转运体，但在翻转过程中，它仍位于脂双层中。我们所提出这种机制与适用于 其他转运体的经典 交替通路模型 是有本质区别的。 脂质从膜的一侧转至另一侧 ，被称为翻转，这不仅是维持膜的不对称性所必须的，而且也是许多生化过程的
3、 基础，比如说，信号传输、分泌和细胞内吞中的囊泡形成、膜蛋白活性的调节和 蛋白质天冬氨酰残基的糖基化。在动物中，脂质双分子层两侧的不对称性影响 着许多活动，比如说凝血作用 、巨噬细胞识别过程和细胞凋亡。在细菌中，细胞壁成分的前体物质 被 耦联在脂质载体中，随着脂质的翻转而运出细胞外，这对细胞壁的形成来说是极其重要的。 翻转反应是由主动的， 或者说活跃的转运体蛋白所催化。这些蛋白包括通过消耗能量使得脂 质在双分子层随机分布的爬行酶（ scramblases）， 由 H+或 Na+驱动的对向运输载体，和由 ATP 驱动的 定向转运特定脂质的 转运体 。后者包括 P4-ATPases 和 ABC 转
4、运体。 尽管有了广泛 的研究， 但关于由翻转酶催化的脂质快速翻转反应的 过程和机制仍然知之甚少。直到现在，只有细菌翻转酶的核心 MsbA 蛋白的晶体结构被报导公布出来，但是根据这点资料 无法推断出任何相关机制。除了缺乏结构 方面的资料 外， 可用于天然底物翻转反应研究的可靠体外试验 分析 也太 稀 少。 原核生物翻转酶的一种主要底物是 Man5GlcNAc2-PP-dolichol，一种 脂连接寡聚糖（ LLO）， 它可以 从内质网膜的胞质一侧转移至网腔一侧，然后寡聚糖链被转移到新合成肽链的天冬氨酸残基上，从而形成 蛋白质的 N-连接糖基化。在同源细菌的 N-连接糖基化途径中，一种化学结构 类
5、似的 LLO（ GlcGalNAc5Bac-PP-undecaprenyl）在人类致病菌 空肠弯曲菌中出现了翻转。作为该过程的催化酶， PglK 是一种同二聚体的 ABC 转运体， 并且在细菌蛋白质N-连接糖基化过程中是必不可少的。 在 寡聚糖链转移酶 PglB作用下，已 翻转的LLO 的 寡聚糖链部分 被转移到 受体蛋白质上；而 十一异戊二烯焦磷酸盐 部分 然后在十一异戊二烯焦磷酸酶的催化下水解为单磷酸盐。 为了探明 由 ATP驱动的 LLO 翻转 反应 的机制 ，我们研发出了体外分析方法，并测定 出了空肠弯曲菌的 PglK 在不同状态下的晶体结构。我们的研究 结构揭示了这样一种机制：只有
6、PglK 的外部 构象与翻转 反应有关，从而在允许寡聚糖链穿过转运蛋白的情况下，而附着在 PglK 表面的多聚异戊二烯尾 仍然 部分 嵌在脂双层中。 这一新提出的机制与用于解释目前研究的大多数转运蛋白催化机制 的交替通路模型迥然不同。 体外实验中 PglK 催化 LLO 翻转和 ATP 水解的 活性 人们之前已 经采用放射性同位素标记的天然脂质来研究多聚异戊二烯连接的寡聚糖 的翻转过程。 然而我们发现 PglK 无论是在体外还是在体内，都可以催化寡聚糖链有所缩短的 LLOs。于是 ，我们再重组 PglK 和一种 糖链部分为 三糖 的 LLOs（ tLLO）， 得到了一种蛋白脂质体。这种蛋白脂质体 （ Fig.1a ） 有一个还原末端和两个 N-乙酰半乳糖胺（ N-acetylgalactosamine， GalNAc） 部分 。 此外，还使用了纯化的糖基转移酶 PglH。这种酶在空肠弯曲菌中的 N-连接糖基化过程有着重要作用，它可以使 tLLO 的非还原端最多加上三个 GalNAc 残基。我们借此来对位于蛋白脂质体外层可被翻转的 t
