1、 中文 8800 字 出处： Machleidt T, Robers M, Hanson G T. Protein labeling with FlAsH and ReAsHJ. Methods in Molecular Biology, 2007, 356:209-220. FlAsH 和 ReAsH的蛋白标记 Thomas Machleidt, Matt Robers, and George T. Hanson 摘要 人 健康 或 疾病 ， 活细胞中的生化 表象 和表型变化 ， 已成为调查和 了解管理 所有细胞生理功能 分 子机制的关键 。 报道者指出，已证明 来自荧光蛋白（ FPS）的基
2、因编码 ， 在活细胞中的定位和相互作用的研究是非常有用的。然而，大尺寸和 FP 的 光谱 属性对他的 使用 产生了一定的局限性。最近开发的荧光含砷 U形 （ FLASH / 四半胱氨酸序列 ）粘结剂技术成为一个 用于 FP 蛋白标记和细胞定位研究有前途 的替代品 。 具有 一个小分子检测试剂 盒的 一个 小的 基因编码的肽标记 组合 ，使得这项技术特别适合 很难与 作为分子标记 的荧光蛋白相联系的活细胞的生化变化的调查。我们描述了这项技术的实际应用 于 活细胞图像的蛋白质动力学。 关键词： 双砷化合物 ， 闪光 ;荧光 ;荧光蛋白 ;网关 ;高内涵筛选活细胞成像 ;Lumio;蛋白激酶 C，蛋
3、白标记 ; ReAsH;试卤灵 ;标签 ; 四半胱氨酸序列 。 1、 介绍 目前的高含量分析 最主要的表现是， 使用免疫荧光 作为 主要的标签 /检测方法 为终点分析 。虽然， 由于 它的灵活性和易用性 使 这方法很有价值 ，但是作为 终点分析 是有限的 。在活细胞中蛋白质的动态实时分析的能力是为深入了解 与细胞行为与功能相关的 复杂的生化和表型变化（ 1） 。 传统上，在活细胞中蛋白质的分析和检测。 主要是依靠作为 基因编码标签 的荧光蛋白 的使用 （ 2）（ FPS）。尽管其 拥有对 蛋白质动 力学 分析的 通用性和 实用性 ，使用的FPS 有一定的局限性。因为它们的 FP 大小（ 28
4、KD）有 潜在的 干扰 融合部分 的活动，定位，或 结 构 并且能够， 通常 仅 可以融合 N 或 C 为终点的蛋白质 （ 3） 。 此外， FPs 只提供有限的有一股 相对缺乏有用的红色 FP 版本 的 频谱 品种 ， 即使 最近有报道 增强 红色 FP 变种的发展（ 4）。 近年来， 为 解决 FPS 的一些问题， 一些替代活体细胞标记方法已被引入（如频谱的限制）（ 5,6）。然而，所有 已 公布的 方法，都 依靠相当可观的多肽的融合蛋白，因此，与 FP 的共享 ， 具有靶蛋白功能的立体标记存在潜在干扰的缺点 。 最近 在加州大学圣迭戈分校的 Roger Tsien 小组 ， 开发出一种在
5、活细胞 特别 标记蛋白 方法，使用亲和力很高的小肽标记 和一个小分子的标签（ 7）。这项技术利用 高亲和力的四半胱氨酸序列 （ TC）， 由两个氨基酸间隔区分离的两个半胱氨酸组成，在 还原条件下 形成有机砷化合物 （图 1）。成功地利用了这一原则产生荧光砷发夹粘结剂（ FLASH），包含 4和 5位置四半胱氨酸替换 膜的渗透染料荧光衍生。两个半胱氨酸对结合具有高亲和力（已在 ref.8 有记录， 通过四个可逆的共价键的形成一个有效的离解常数 10-11 中号的 Flash 组（图 1）。 融合了 TC 标记 的目标蛋白质 的基因 ， 在 biarsenic 标记 荧光染料 培养，活细胞中 允许
6、特定的 标记的融合蛋白 7）。最早的的 TC 标记被设计成 为短 公认的 -螺旋的图案 ，依从的是 一个 -螺旋结构提供了一个最佳的结合环境 的假设 （ 7）。然而，进一步系统调查不同的间隔 区的TC 图案 ， 破解 插入螺旋甘氨酸和脯氨酸 ，导致 大大增强 FLASH对 TC 图案的 亲和力（ 8）。这项技术的另一个方面是，显示了一点荧光 的未绑定的 ，直到它绑定到 TC 的 图案 ， 结果会导致 荧光约束力的大量增加（ 7）。 Tsien 实验室 通过 biarsenical 染料 发展， 扩大两 个 TC 标记的颜色范围 ，试卤灵派生的红色荧光染料 ReAsH和蓝色荧光 biarsenical 的 CHoXAsH， 3,6 - 二羟基酮衍生物（ 8）。这项技术也被应用于蛋白质的构象 调查 （见注 1）。例如，基于红色荧光和尼罗河的两个环境敏感 biarsenical染料 ，在 Yoshio Umezawa 的实验室监测钙钙调 蛋白诱导的构象变化 时被发现 （ 12,13）。 到目前为止，尽管其相对有限的使用 ， 有 各种各样发布 的
