1、PDF外文：http:/ 中文 7600 字 出处： Fan Y, Ma X, Zhang J, et al. Ophiopogon polysaccharide liposome can enhance the non-specific and specific immune response in chickensJ. Carbohydrate polymers, 2015, 119: 219-227. 英文题目 ： Ophiopogon polysaccharide liposome can enhance the non-specific and specific immu
2、ne response in chickens 麦冬多糖脂质体可以提高鸡的非特异性和特异性免疫应答 摘要 ：本实验研究的目的是探讨麦冬多糖脂质体（ OPL）的免疫增强活性。在非特异性免疫应答实验中，吞噬和细胞因子分泌是在在体外和体内的巨噬细胞中进行。在特异性免疫应答的实验研究中， OPL 的活性是在鸡中测量的，那个实验所用的鸡是被接种了纽卡斯尔病疫苗并且挑战 ND 病毒 49 天。结果表明， OPL 能显著促进巨噬细胞的吞噬功能和在体外诱导 IL-2 和 IL-6 的分泌； OPL 在高与中剂量 组能显著提高吞噬指数，促进淋巴细胞增殖，增加 T 淋巴细胞亚群的比例（ CD4 +和
3、CD8 +），提高抗体效价和提高在体内的保护率。此外，其疗效显著优于麦冬多糖（ OP）。这些结果表明，用脂质体包裹后的 OP 的免疫增强活性显著增强。 关键词 ：麦冬多糖脂质体、免疫增强活性、非特异性免疫应答、特异性免疫应答。 缩写 ： OP- ophiopogon polysaccharide 麦冬多糖 ；OPL- ophiopogon polysaccharide liposome 麦冬多糖脂质体 ； ND-Newcastle disease 纽卡斯尔病 ； IL- interleukin 白细胞介素 ； PHA-phytohemagglutinin 植物血凝素 ；
4、 MTT-3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide 3（ V/V） -二苯基溴化 ； PBS-phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲盐水 ； DMSO-dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 ； NDV-Newcastle disease virus 纽卡斯尔病毒 ；VC-vaccine control 疫苗控制 ； BC-blank control 空白对照 ； BL-blank liposome 空白脂质体 ； CC-cell control 单元控制
5、。 1.简介 动物疫病对我国养殖业有严重和广泛的影响，比如，纽卡斯尔病，禽流感病毒，猪繁殖与呼吸综合征等经常发生，带来业务上的巨大损失。这些疾病大多属于病毒性传染病。目前，由于缺乏特异性治疗，疫苗仍然是预防和控制病毒感染性疾病的主要手段。然而，大多数疫苗尤其是基因工程疫苗在免疫增强剂的帮助下可以取得令人满意的效果，免疫增强剂在提高疫苗的效果上起着至 关重要的作用 (Zhao et al., 2014)。而我们所使用的化学剂目前在临床上有一些缺点，如易累积，单目标，副作用大等 (Harandi, Medaglini, Shattock, &am
6、p; Working Group convened by EUROPRISE, 2010； Ma, Guo, Wang, Hu, & Shen, 2010)。 多糖是生活的四种基本物质构成之一，具有多种生物活性，如免疫调节，抗病毒，抗肿瘤，抗氧化，抗炎等 (Kouakou et al., 2013)。在多糖的众多生物活性 中，免疫调节影响是最显著的。所以在中国多糖医学上也被称为免疫活性多糖 (Li,Nie, Xie, & Li, 2014； Zhang et al., 2013)。作为一种天然高分子活性物质，多糖不仅能激活免疫细胞，提高抗体水平，促进
7、细胞因子的释放和激活补体，而且在病毒控制和治疗癌症上也起着重要的作用 (Schepetkin et al., 2013； Sheu, Lyu, Lee, & Cheng, 2013)。此外，当多糖在调节机体的免疫功能时不会产生明显的副作用，在临床应用上它是理想的免疫增强剂。 麦 冬（麦冬方法），作为一个中药，它的使用可以追溯超过 2000 年前，被记录在神农本草经里。麦冬多糖（ OP），作为麦冬的主要活性成分，具有较强的免疫增强，如增强吞噬细胞的吞噬功能和提高体液免疫和细胞免疫 (Lin et al., 2010； Xiong, Li, Huang, Lu,
8、 & Hou, 2011； Wang, Sun, Zhang, Chen, & Liu, 2012)。 Xu et al报道称，原油麦冬采用水提醇沉法分离制备多糖和采用超滤法纯化， DEAE-琼脂糖凝胶 FF和 Sephadex G-100柱层 析，然后它的结构被完全水解后用高碘酸氧化，史密斯降解，甲基化分析， 1H NMR 和 13C NMR 分析研究。结果表明， OP 是一种水溶性的 - d-果聚糖，包含一个骨干由 FRUF（ 2 1）和 FRUF（ 2 6）， FRUF（ 2主链残基的平均值 2.8）的一个分支组成。 OP 的分子量为 5000。
9、 OP 的还原性末端连接对 - D 葡萄糖，和果糖葡萄糖的摩尔比约为 35： 1(Xu et al., 2005)。 然而，由于其高的亲水性和 2 nm 左右分子的大小， OP 的半衰期短， OP 是 通过肾直接迅速 地 排出体外 ，导致在靶组织中 的分布更少和在生物体中的不稳定性。以上所有不满意的 药代动力学特征 严重限制了 OP 的临床应用 (Lin et al., 2010)。因此，为了提高和更好地发挥药理作用的生物利用度，开发一种新的 OP制备型或选择一个改善 OP 的药代动力学特征的高效载体是特别重要的。 脂质体，
10、在药物输送系统中作为重要的研究内容之一，已受到越来越多的重视是因为它的优点如延长药物作用，提高稳定性，降低毒性等 (Ohnishi et al., 2013)。目前，在中医上脂质体的研究已成为一个热点。我们的初步研究表明，淫羊藿多糖和黄芪多糖被 制成脂质体后能显著提高他们的免疫增强活性和延长药物的效果 (Fan et al., 2012； Gao et al., 2012)。多糖是由十多个单糖分子或通过糖苷键连接单糖衍生物组成，不同种类的植物多糖有类似的结构。因此，我们推测，OP 脂质体（ OPL）也可以达到较好的免疫增强活性，克服在体内迅速代谢的缺点当与 OP 相比时。 &nb
11、sp; 因此，在本实验研究中，通过在体外和体内的巨噬细胞腹膜评价 OPL 提高非特异性免疫应答的活性，对于诱导体液和细胞免疫抵抗 ND 疫苗，增强特异性免疫应答的活性也进行了评价。本实验研究的目的是 探讨脂质体是否可以进一步提高 OP 的免疫增强活性和选出一个新型的 OP 制备方法。 2.材料与方法 2.1 材料 麦冬多糖（ OP 净含量 98.8% ）是本实验室根据文献制备的 (Xu et al., 2005)。大豆磷脂（号 20130304）是由上海泰威制药有限公司制造的，胆固醇（号 20130916）是从安徽天琪化工技术有限公司购买的，
12、鼠抗鸡单克隆抗体 (anti-CD80-FITC and anti-CD86-PE)是由 BioLegend 公司（美国）提供的。培养基（ GTBCO）与补充的100 IU 每毫升的青霉素、链霉 素和 10%胎牛血清被用来清洗和重新悬浮细胞，稀释有丝分裂原和培养细胞。植物血凝素（ PHA， Sigma），作为一种 T 细胞有丝分裂原，被分解为 0.1 毫克每毫升用于培养。汉克斯液被用于稀释血液。 3（ V/V）- 2 diphenyltetrazo 溴化钾（ MTT，美国公司）用钙和镁的磷酸盐缓冲盐水（ PBS，pH7.2）溶解为 5 毫克每毫升的溶液。这些试剂用 0.22 um 微孔膜过滤器
13、过滤。二甲基亚砜（ DMSO）是由正兴化工有限公司生产的（苏州，中国）。 2.2 OPL 的制备和表述 采用逆相蒸发法制备 OPL。首先， 胆固醇和磷脂分别用氯仿溶解，然后将含OP（ 4 毫克每毫升）的 PBS 注入氯仿溶液。混合匀浆，通过超声在冰浴中形成稳定的油包水型（ W / O）乳液。第二，乳液采用真空旋转蒸发仪蒸发形成胶体，然后加入 20 毫升 PBS 到水合物中搅拌 15 分钟。第三，所得混合物均匀再利用超声波超声 20 分钟形成均匀的脂质体。最后，该脂质体使用 0.45 和 0.22 um微孔膜先后过滤。根据参考用鱼精蛋白和硫酸苯酚法检测
14、OPL 的包封率 (Gunter, Gunter, Jarkowski, & Rosier, 1982)。 OPL 的包封率为 64.95%，平均颗粒尺寸、 zeta电位和 PDI 分别为 245.3 nm、 4.56 mV 和 0.326。本文的粒径分布谱和透射电子显微镜观察在补充数据被显示。在体外试验中， OPL 是被溶解成 2 倍系列稀释成五个浓度培养。在体内，它是用 PBS 稀释成三个剂量。它们的内毒素量达到了中国兽药标准药典（小于 0.5 EU mL1），它们被存储在 4C 用于实验。 2.3 实验动物 一天大的白罗曼鸡（雄性）被安置
15、在装有空调的 37C 房间的电线笼 (40 cm 60 cm 100 cm)中，其房间在审前阶段的开始时每天光照 24 小时。温度逐渐下降到室温，光照时间为每天 12 小时，并在接下来的日子里一直保持下去。鸡喂食所用的商业饮食由陕西正大有限公司饲料厂所提供的。动物及其护理相关的所有程序符合国际公认的原则，同样发现了由中国政府颁发的饲养实验动物的指南。 2.4 关于非特异性免疫应答的 OPL 活性 2.4.1 腹腔巨噬细胞的分离和培养 根据以往的报告，用轻微修改的腹腔灌洗法分离巨噬细胞 (Snchez-F
16、idalgo et al., 2013)。鸡（ 14 日龄）被腹腔注射 2 毫升 6%淀粉 肉汤。两天后，腹膜腔用 20 毫升 PBS 洗涤 ，收集巨噬细胞腹腔液。在以 2000 rpm 离心 10 分钟后，收集细胞，用 PBS 洗两次。然后将细胞悬浮在 RPMI-1640 中，在 37.5C 潮湿的含5% CO2 的大气中在种子培养板（ 1 106 个细胞每毫升）上培养 2 小时。非贴壁细胞用两次培养液轻轻洗去，贴壁细胞是巨噬细胞。用台盼蓝法测定的细胞活力从不在 95%以下。 2.4.2 关于体外培养的巨噬细胞吞噬功能的 OPL 活性 采
17、用中性红吸收法测定巨噬细胞的吞噬功能 (Chen, Zhang, Shen, & Wang, 2010)。在培养 OPL 或 OP 48 小时后 ，加入 100 uL 中性红溶液（ 0.075%， w / w）培养 4 h。弃上清液后，用 PBS 清洗两次细胞去除没有被巨噬细胞吞噬的中性红。然后将 DMSO（ 100 uL1）加入到溶解的巨噬细胞中。在 490 nm 处的吸光度用酶标仪测定。 2.4.3 IL-2、 IL-6 的测定 细胞接种于 96 孔培养板。在接受治疗或无药 48 h 后，盘子在 1000 g 离心10 分钟，并
18、收集培养上清液用 ELISA 试剂盒（ biosamite 生物技术有限公司，上海，中国）根据制造商的指示，测定 IL-2、 IL-6 的含量分别为多少。 2.4.4 在体内的吞噬指数的 OPL 活性 根据先前描述的方法通过碳粒廓清测定巨噬细胞的吞噬指数 (Wang, Wang, Li, Shi, & Zhong, 2009)。九十只 14 日龄雏鸡被随机分为六组。五个实验组的鸡分别被肌肉注射 1 毫升的 OPL 剂量为高等（ 4 毫克每毫升）、中等（ 2 毫克每毫升）和低等（ 1 毫克每毫升）， OP（ 4 毫克每毫升）和空白对照组，在空白脂质体组用生理盐水，每天一次，连续 3 天。在末次给药后 7 天和 14 天，分别从每组随机选择出六只鸡，以 1 毫升 / 100 克体重的量静脉注射稀释的印度墨水。在 2 min（ T2）、10 min（ T10）从肱静脉收集血液样品，然后将 20uL 血液与 2 毫升 0.1%碳酸钠混合。用紫外可见分光光度计测定在 600 nm 的吸光度。将肝脏和脾脏称重，吞噬指数计算公式为： K =（ lg OD2lg OD10） /（ T10T2）。吞噬指数 = K1 / 3
