1、PDF外文：http:/ 3825 字 出处： Kristmundsdttir T, Jnsdttir E, gmundsdttir H M, et al. Solubilization of poorly soluble lichen metabolites for biological testing on cell linesJ. European journal of pharmaceutical sciences, 2005, 24(5): 539-543. 不溶性地衣代谢产物的增溶作用在细胞系的生 物学测试 摘要 :
2、荔枝素缩酚酸和富马原岛衣酸缩酚酸环醚，分别是从珊瑚枝属的高山柳叶菜地衣和冰岛地衣属提取出来的，分别被选做为不溶性天然化合物的原型，以方便在药理模型中的测试。增溶剂在之前就被认定是做为从无毒性走向一个恶性白血病（ K-562）细胞株和氧芴地衣代谢物（ +）地衣酸溶解研究中使用的缩酚酸及缩酚酸环醚的反增生性活动的测试。环糊精衍生物是之前发现的最适合增溶的地衣化合物，已经确认在富马原岛衣酸的溶解度上有了最大的提高，从水中0.03mg/ml 到 8.98mg/ml 在 10%的 2-羟丙基 - -环糊精（ HP CD），提高了将近300 倍。随后 ,地衣化合物包括（ +）地衣酸，溶解在 10%的 HP
3、 CD 中，测试在 3种恶性的人类细胞系： T-47D（胸腺）， Panc-(胰腺 )和 PC-3（前列腺）的标准细胞增殖实验。荔枝素和富马原岛衣酸没有展现出有反增殖影响，但是地衣酸可以有效的对抗所有测试细胞系和半数效应浓度值 4.3 8.2 g/ml。在本实验中使用的无毒的增溶剂可以证明其他可溶性就差的天然产品的药理学测试。2005Elsevier P.V，保留最终解释权。 关键词： 地衣代谢物；溶解度；细胞系；富马原岛衣酸；荔枝素；地衣酸 。 1.介绍 冰岛地衣中的一些次级代谢产物在人类恶性细胞系测试中展现了可喜的反增殖结果。
4、相同原料的代谢产物在无毒溶剂中的进一步测试是存在的但是经常被不溶性的所阻碍。许多方法是可以试着去增加不溶性物质的溶解度，比如使用助溶剂，表面活性剂，有机络合剂。然而这些方法必须是对培养基中的细胞无害的溶剂系统。在先前研究地衣代谢物（ +） -地衣酸（图 1）中，氧芴衍生物作为原型的目的是找到一个既能够溶解地衣酸，同时不会对细胞系的测试产生影响的不溶于水的天然产物。各种溶剂和络合剂的直接产物是用来在人类白血病细胞K-562 标 准细胞增殖实验中的测试。大部分的化合物是有毒的，除了聚乙二醇 400（ PEG400）和 2-羟丙基 - -环糊精络合剂（ HP CD）。地衣酸的反增生活性可以证明使用
5、PEG400 和 HP CD 的半数有效浓度 4.7 g/ml，但是只有后者给出了满意的溶解度。 2-羟丙基 - -环糊精因此被作为一种增溶剂，因为它同时满足溶解度以及对细胞测试的无毒性。地衣酸在每日摄取 100200mg 剂量时会引发肝中毒。除了氧芴衍生物比如地衣酸，地衣类的次级代谢产物有很大数量的缩酚酸和缩酚酸环醚的化学分类。两者都是通过芳香羧酸的酯化反应形成的 单位。除了酯键和含有一个分子内氧桥的缩酚酸环醚。许多这种化合物在地衣类是结构独特的，很值得去进行药理测试。然而很多时候他们的溶解性很差。目前调查的目标是双重的，首先是选择一个说溶性很差缩酚酸和缩酚酸环醚的典型，并且在使用之前找到的
6、对细胞系毒性很小的溶剂和络合剂时能够明显提高他们溶解度。分别选中了从冰岛珊瑚枝属高山柳叶菜中提取的荔枝素和从冰岛衣多毛属提取的富马原岛衣酸。其次是在 3 中人类恶性细胞系中测试地衣代谢物和地衣酸的影响，也就是在 T-74D， Panc-1,Pc-3（胸腺、胰腺、前列腺癌）中进行标准细胞增殖实验。 2.材料和方法 2.1 提取地衣物质 就像之前描述的荔枝素是从美国珊瑚枝科 alpinum Laur 中提取出来的，富马原岛衣酸是从梅衣科冰岛地衣中提取出来的，地衣酸是从石蕊科中提取出来的。 2.2 材料 &nb
7、sp; 聚乙二醇 400(PEG400)和丙二醇是从美国圣路易斯的西格玛化工有限公司购买的， HP CD 是美国印第安纳州的 Cerestar 公司赠送的， HP CD 是来自 W8惠普制药公司的环糊精和瓦克公司的环糊精，全部的化学药品都是优级纯试剂。 2.3 溶解度测定 将过量的纯地衣物质和 2ml 增溶剂放置在 10ml 的玻璃瓶中，增溶剂使用PEG400 和丙二醇，未稀释的和 10%含水的溶剂，环糊精 HP CD 和 HP CD 分别从10%浓度到 40%。水溶剂通富哦磷酸调整至 PH48.将试剂瓶保存在回转式震荡恒温水槽，设置温度为
8、25 摄氏度。 70 小时后采集样品，透过 0.15 m 的膜滤器过滤，稀释至所需要浓度，集中的地衣物质样品通过高效液相色谱分析，每次实验做三次。 2.4 高效液相色谱法测定地衣物质 大量的荔枝素、富马原岛衣酸和地衣酸溶液决定要使用惠普公司生产的1050 系列泵的高效液相色谱仪、默克公司的加拿大泵 RP18 25m（ 3.9mm*250mm）以及惠普公司生产的 1050 系列的紫外检测器。波长是 235nm，流动相包括甲醇、水、 H3PO4，比例是 8:20:0.9。荔枝素在 2.0mg/min 流量的保留时间为 8.0 分钟，富马原岛衣酸是
9、 3.0 分钟，地衣酸是 7.1 分钟。 2.5 细胞增殖实验 以下列细胞系进行测试 :T-74D(胸腺 )， Panc-1（胰腺）和 Pc-3（前列腺）。都是来自美国菌种收藏。细胞在辅以谷氨酸以及 50IU/ml 青霉素和 50ml 带有牛血清的链霉素的 RPMI 的标准条件下培养（所有都来自英国佩斯里的 GiPco 生活科技公司）。将测试细胞放置在 104细胞 /96 孔板中。受试物逐步添加到里面稀释。 24 小时候将 1Ci3H胸腺嘧啶（英国的 Amershan 淀粉微球生物技术公司）添加到每个孔中，然后继续培养 6 小时。然后将细胞收
10、在惠普公司的 C961960的细胞滤波器，然后放在 MicroscintO 进行液体闪烁测量。放射性以 TopCount进行闪烁计数（帕卡德仪器都来自美国的康涅狄格计数器）。结果以未经处理的百分比表示。 3.结果 3.1 增溶剂对荔枝素的增溶作用 使用 HPLC 时，荔枝素在水中的溶解度是不能被检测的。一种尝试是使离住宿溶解，用荔枝素溶液并与提前找到的适配的络合剂进行细胞学测试，即丙二醇。PEG400 和 HP CD。荔枝素在纯 PEG400 中溶解度是 0.37mg/ml，在丙二醇的溶解度是 0.017mg/ml，但是荔枝素在
11、10%水混合物和他们溶液中的溶解度是无法测量的。但是，荔枝素在 HP CD 中是可以溶解的，图 2 显示荔枝素在 PH 为 6 的 10%HP CD 溶解度很低，但是在 PH 为 8 时，有更高的溶解度 0.0055mg/ml。尽管 PH为 8 的荔枝素溶解度比 PH 为 7.4 的生 理的高，但是后者是选择作为细胞实验的。由于荔枝素在 HP CD 中的溶解度很小，所以尝试去选择 HP CD 增加溶解度。 环糊精的中心空腔比 环糊精的要大，因此它可能使地衣化合物的溶解度更高。但是，这并非如此。图 3 显示的是环糊精浓度在 PH 为 7.4 的荔枝素的溶解度。溶解度的增加与增溶剂浓度做了一个函数
12、，但是还是有很小的不同：在后面得到的两个环糊精和 HP CD 在高得浓度测试中相对要好。 3.2 增溶剂对富马原岛衣酸溶解度的影响。 富马原岛衣酸在水中的溶解度是 0.0325mg/ml，在 PH 为 4 时溶解度是0.0069mg/ml，并且随着 PH 的增加溶解度也在增长，在 PH 为 7.4 时，溶解度是2.83mg/ml。在同时使用 PEG400 和丙二醇时，富马原岛衣酸的溶解度要比只有水的时候要好，但是由于在这些溶液中的化合物的分解是通过 HPLC 测量的，所以它不能反应溶解度。富马原岛衣酸的溶解度在 PH 为 7.4 的 10%的
13、 HP CD 中是8.98mg/ml。分解在环糊精溶液中可能是看不到的，因为一部分富马原岛衣酸的很适合非极性的环糊精空腔并可以从外界环境中保护它。 3.3 地衣化合物对细胞吸收胸苷的影响。 将地衣酸、荔枝素和富马原岛衣酸 三种地衣化合物溶解在 10%的 HP CD 溶液中，并分别在 Panc-1、 T-47D 和 PC-3 的 PH 为 7.4 的细胞系中进行测试。松萝酸在溶剂浓度为 10 l/ml 中抑制 Panc-1 的半数有效浓度是 4.3 g/ml，与之相比松萝酸对 K-562 的半数有效浓度是 4.7 g/ml。松萝酸抑制 T-47
14、D 的半数有效浓度是 2.9 g/ml，抑制 PC-3 的半数有效浓度是相对高的： 8.2 g/ml。计算得到这个半数有效浓度对溶剂有直接的影响。 HP CD 这个增溶剂对 PC-3 和 Panc-1没有明显的作用，但是 T-47D 是更加敏感的，而且 在有效的剂量范围内对胸苷的吸收有一个明显的 3080%的减少。荔枝素对 T-47D 的溶剂和溶解度的抑制作用就像那个是很有限的，也是因此决定不在其他细胞表面进行试验。富马原岛衣酸对 T-47D 和 Panc-1 并没有一个很好的抑制作用。 4.讨论。 现在溶解度研究是选择最好的使用溶剂，并且它
15、有很小的溶解度，而且还是在地衣类中是广泛分布的。尽管它们相对其他地衣代谢物相对丰度是很高的，这些化合物在药理的观点内从未收到应有的重视。 先前的工作已经确定了在细胞培养中的适合的增溶剂：丙二醇、 PEG400、 HP CD。 HP CD 是已经发现的有增加氧芴衍生物地衣酸抑制恶性细胞系测试的溶解度（ Kristmundsdottir et al.,2002） .在试图使用增溶的化合物去增加及其不佳溶解度的缩酚酸衍生物荔枝素和缩酚酸环醚衍生物富马原岛衣酸后，发现缩酚酸环醚比缩酚酸更容易溶解。荔枝素溶解度的增加顺序是：无 -HPLC-在水中检测的 HPLC-
16、使用 HP CD 和 HP CD。这种增加不能足够的曾明明显的反增生实验，荔枝素也不能证明是及其困难增溶的候选物。荔枝素在细胞增长方面与它的溶剂相比不能引起明显的减少，因此不可能做出任何假设在 荔枝素的反增生反应是由于它的很差的溶解性。另一方面富马原岛衣酸在水中的溶解度从 0.03mg/ml 增加到了在 10%HP CD 的 8.98mg/ml，因此具有更多刚性环的富马原岛衣酸比荔枝素更适合环糊精空腔。除了增加溶解度， HP CD 溶液也可以增加富马原岛衣酸的稳定性。大概延胡索酸酯可以保护环糊精复合物的水解，由于地衣代谢物和环糊精的常量联系。富马原岛衣酸不能在细胞培养中展现反增生性。尽管有很好的溶解性和对溶剂系统的无毒性。
