1、 中文 4912 字 译文： 高表达和纯化的 Tat-haFGF19-154 High-level expression and purification of Tat-haFGF19-154 Yadong Huang, Yulan Rao, Chengli Feng, Yanmei Li, Xiaoping Wu, Zhijian Su, Jian Xiao, Yechen Xiao, Wenke Feng, Xiaokun Li 摘要 ： 人的酸性成纤维细胞生长因子在各种组织损伤后能够刺激修复和再生中央和周围神经 ,然而，它不能穿过血脑屏障。为了生产具有细胞渗透性的治疗性的酸性成纤维细胞生
2、长因子，我们 用 Tat-PTD技术融合 haFGF19-154基因。在这之后用 PCR技术扩增编码序列，使 pTathaFGF19-154-His在大肠杆菌 BL21中得以表达。最佳表达的可溶性融合蛋白超过了总细胞蛋白的 36.7%。 Tat-haFGF19-154-His的重组体被具有NiNTA活性，葡聚糖凝胶 G-25和肝素亲和的色谱柱组合体纯化 95%。这数据用十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺酰胺凝胶电泳检测得到，最终产率为 171 mg/l培养物。 纯化的 Tat-haFGF19-154-His具有在 Balb/c3T3细胞中不同的有丝分裂促进活性，用 MTT法测量它的半数有效量为 3.9
3、31104 mol/l。 Tat-haFGF19-154-His的蛋白以每剂量为 10 mg/kg静脉注射在大脑皮层和海马中检测得到。 关键词 ： 酸性成纤维细胞生长因子； Tat-PTD表达；纯化；有丝分裂促进活性 前言 人酸性成纤维细胞生长因子（ haFGF） 是一 个有力的广谱促细胞分裂剂 。体外研究显示酸性成纤维细胞生长因子能刺激细胞生长 过程 中 对 胚层和神经外胚层来源 （ Gimenez-Gallegoand Cuevas 1994） 的影响 。奎瓦斯等 在 1997年 到 1998年 间 发现，酸性成纤维细胞生长因子具有内分泌类的活动，可以作为一 个 血管扩张，内脏缺血的保护者
4、 ，调节神经 。酸性成纤维细胞生长因子 在 神经生长和发展中起着举足轻重的作用。 以往的研究表明， 酸性成纤维细胞生长因子 在海马，纹状体和下丘脑神经细胞增殖的同时增强生存能力和刺激睫状视网膜神经节以及刺激周边神经元。这是1988年立顿等人和 1991维尔科克厮等人所证明的。 haFGF能够促进神经上皮细胞迁移和规范对脑神经祖细胞的分化和促进修 复和再生有伤的中枢和外周神经，之后还 能营养作用神经元。这是英杰和博恩在 1992年及纳曼在 1996年所证明的。外源性的haFGF具有以衰减最初的毒物的可创性和持续时间来减轻海马细胞的消亡和神经元细胞的消亡 (Cuevas et al. 1994；
5、Cuevas and Gimenez-Gallego 1996)。 haFGF有效保护了由脑缺血所引起的损害海马锥体细胞的 CA1(Sasaki et al. 1992)。对神经系统的这些作用表明在治疗如毒物 (Jankowsky and Patterson 2001)、 帕金森氏病、脑缺血(Sasaki et al. 1992)以及大脑皮质损伤 (Figueiredo et al. 1995)等多种疾病时存在一定的潜力 (Date et al. 1990； Alexi et al., 2000)。事实表明，上述疾病的动物模型试验显示haFGF有良好的治疗效果。 在跨越血脑屏障 （ BBB）
6、的治疗性蛋白质交付限制其规模和生物化学特性。具有 154个氨基酸的 haFGF蛋白质，不能直接穿过血脑屏障 从循环 ，但可以通过脑内注射入脑室 (Li et al. 1998； Mufson et al. 1999)， 渗透 性 开放 的 血脑屏障 (Rapoport 2000； Emerich et al. 2001)或病毒载体 (Federoff et al.1992). 不过，脑内注射可能会损害 大脑组织，引起感染 。 开放是选择 性渗透 ，不 可能允许进入大脑的其他物质进入。基因治疗有经验的低效配置和较低的长期蛋白的表达。 因此， aFGF对中枢神经系统疾病的治疗在临床方面还受到严重的
7、限制。 近年来，新的战略已经发展为加强血脑屏障的通透性 (Schwarze et al. 1999； Bayley 1999； Dietz et al. 2006； Yin et al. 2006)。一种方法是融合靶蛋白和穿膜肽细胞(CPPs)，如 Tat-PTD，控制触角基因的蛋白，单一的疱疹病毒 -1VP22,卡波西氏的成纤维生长因子信号序列 (Bayley 1999； Dietz et al. 2002)。 Tat-PTD，来自艾滋病毒反式转录激活 （ TAT） 获得 的 9或 11个氨基酸片段，与各种蛋白质 进行 融合 后 运送到大脑(Elliott and OHare 1997)。到
8、目前为止 ， 几个 TAT融合蛋白，如 PTD-Bcl-xL, PTD-GDNF, PTD-tyrosine hydroxylase,PTD-calpastatin, and PTD-SOD，已被证明具有穿越血脑屏障的疗效并有治疗作用 。 在脑疾病实验模型 (Cao et al. 2002； Kilic et al. 2003； Sengoku et al. 2004； Kim et al.2005； Dietz et al. 2006； Yin et al. 2006； Wu et al. 2006). 这项研究中，我们 对 haFGF19-154 和 Tat-PTD 49-57 与 蛋白
9、进行融合后 在大肠杆菌中高效表 达和纯化 成接近同质 。纯化的融合蛋白具有明显的 促进有丝分裂活性 ，并能够跨越血脑屏障。 材料和方法 试剂 限制性内切酶 Nde I and BamH I购买来自 Invitrogen公司 (Carlsbad, CA, USA)； 标准 haFGF(haFGF19-154)购自广州维佳（广州 ,中国） ； 质粒 pET - haFGF19 - 154，表达载体 pET3c和大肠杆菌菌株 BL21（ DE3） 获得来自生物医药研究开发中心济南大学 ；Ni-NTA琼脂糖是从 Invitrogen公司（美国） ； CM琼脂糖和肝素 -琼脂糖由 GE医疗 保 健公司
10、(Piscataway, NJ, USA)； 引物合成由上海生工（上海，中国） ； 兔抗多克隆抗体，从武汉博士德生物工程有限公司（武汉，中国）购买。 构建 Tat-haFGF19-154-His and haFGF19-154-His表达载体 这 Tat-haFGF19-154-His互补 DNA被放大由质粒 pET-haFGF19-154由标准聚合酶链反应是由正向引物 F1(5-GGAATTCCATATGCGCAAAAAACGTCGTCAGCGTCGCCG TGCTAACTACAAG-3) 和反向引物 R(5-GCAGATCTTTAGTGATGATGATGATGA TGATCAGAAGAAA
11、CTGGCAA-3)。 正向引物 F1和反向引物 R分别包含 NdeI and BglII 位点 一种近似的 465碱基 扩增片段 被 NdeI and BglII切断然后再将其克隆到pET3c表达载体 ,这载体是 先前已经与 被 NdeI和 BamHI酶切消化 ， 建立相应的 表达载体 pTat-haFGF19-154-His。 另一种表达载体 pTat-haFGF19-154-His，它 是通过相同的程序产生上述使用正向引物 F2(5-GGAATTCCATATGGCTAACTACAAGAAGCCAA AGTTG-3)和反向引物 R.插入基因的精确度通过自动化的 DNA序列测定所证实的。 T
12、at-haFGF19-154-His and haFGF19-154-His的诱导和表达 Tat-haFGF19-154-His and haFGF19-154-His被 表达如下：单一转化菌落 在 4毫升中型的 LB（ 10g蛋白胨 ,10g酵母提取物 ,5g氯化钠溶入到 1升的去离子水中 ） 培养基，培养基中包含 100 g/ml氨苄西林和 1%葡萄糖且在 37C转速为 250转 摇动培养 .经过隔夜培养 ， 100l的 培养物被转移到 50毫升新鲜的不包含葡萄糖的 LB培养基中 ,为了达到指数生长，就是当 OD600值达到 0.6，异丙基 -D-半乳糖硫吡喃糖苷类 （ IPTG)被增加到
13、 0.4 mmol/l终浓度。培养物培养在 37C和 220转动 6个小时 Tat-haFGF19-154-His 和 haFGF19-154-His被十二烷基钠硫酸盐聚丙烯凝胶电泳 (SDS-PAGE)，和他们表达水平被光密度计扫描器分析出来。为 haFGF19-154-His达到纯化的目的 ,培养物被放大到 1.0升的培养基里。 Tat-haFGF19-154-His的发酵 10 微升种子菌株 BL21（ DE3） 中有 pTat-haFGF19-154-His 表达质粒，它是培养过夜的 50 毫升 LB 培养基中有 100g/ml 氨苄青霉素（约 12-14 小时 ；在 220 rpm,
14、 37C下旋转）。接着， 10 毫升的过夜培养基接种到新鲜的 200 毫升 LB 培养基中 ,培养基中含有 100g/ml 氨苄青霉素和在 220 rpm, 37C 下摇床培养，当 OD600 值达到 1.0，培养物被转变为一个 5 升发酵罐包含 3 升的 LB 培养基 ,在这之后 OD600 达到 20。IPTG 被增加到培养基中含有 0.4 mmol/l.终浓度 .诱导过程持续了 5 小时 ,细胞通过离心 5 分钟（时速为 13,523g 在温度为 4C）来收集。然后片状样的细胞被悬浮在20 mmol/l 冰冷的包含 5 mmol/l EDTA (PBS)缓冲溶液当中。悬浮液在冰冷器中超声处理然后离心 30 分钟在转速为 30,427g 温度为 4C。片状沉淀物被清除，上清液被进一步纯化。
