1、中文5200字出处：Journal ofInsect Science, 2010, 10(1): 42PDF外文：http:/ Determination of pH in regions of the midguts of acaridid mites 粉螨中肠 pH 的 测 定 摘要： 螨类中肠的 pH 值强烈影响着他们的消化过程。这个研究确定了 12 种仓储螨的房屋尘螨的中肠 pH 值。在螨类喂食试验中选用了 18 种指示剂。基于指示剂的颜色变化，螨类的中肠内容物 pH 值范围确定为 4-7 之间。中肠内部 pH 从前部到后部呈现梯度变化。大部分物种
2、的中肠前部（前胃和盲肠） pH 变化 4.5-5 之间，有些物种呈现弱碱性 ,而中肠中部（中部结肠） pH5-6。中肠后部 （后结肠）的 pH 在 5.5-7 之间。在测试螨类中除了粉尘螨外其他螨中肠 pH 没有显著地差异。尘螨的中肠酸性更强，前部（ pH4-5），结肠（ pH5)后部结肠（ pH低于 6）。在螨中肠的体内条件获得的结果为螨消化酶活性包括他们的抑制剂和中肠微生物群落的研究提供了有力的帮助。 前言 生态上的螨是重要的害虫，他们的中肠的 pH 值会很大程度影响杀螨作用、病原体感染的成功率、消化过程。研究害虫消化酶活性剂中肠微生物群丛的首先必须是鉴定中肠 p
3、H 值(Skibbe et al. 1996； Terra et al. 1996； Funke et al. 2008)。虽然已有部分确定中肠 pH 值的研究，但是确定生态螨的消化范围的 pH 值的研究还很少。 基本上，比色法、电位测定法、和电导分析法是常用的确定 pH 值得方法 (Carsky 1981)。微电极是昆虫中确定 pH 最常用的工具 (Brune et al. 1995； Harrison 2001； Zimmer and Brune 2005； Gross et al. 2008),但由于螨虫体型极小无法使用。 Skibbe et al. (1996)提出核磁共振
4、成像作为确定昆虫中肠 pH 的可选用的 方法，而此方法不常用。 pH 比色法利用加酸显色化学试剂作为指示剂。酸碱指示剂颜色根据 pH 的改变 而改变成是由奥斯瓦尔德提出的理论，后由汉奇提出互变异构的概念：人类的眼睛能够预计的颜色变化的浓度比率是 10:1-1:10，改变范围约是 pH=pKA(HIn) 1， pKA(HIn)是指示剂的解离常数。根据奥斯瓦尔德理论， pH 指示剂是弱酸或者弱碱， pH 接近值是滴定指数 pT。颜色的改变时由于 H 离子的激活导致指示剂的解离和非解离形式。指示剂在特定 pH 值下不会急剧的改变，但会在一个小范围的 pH 值内改变。指示剂在这
5、个范围 内的某个 pH 值显示中间体的颜色。 (Brdicka and Dvorak 1977； Dvorak and Koryta 1983； Holzbecher and Churacek 1987). 虽然利用 pH 指示剂获得结果与电势测定的结果一致 (Espinoza-Fuentes and Terra 1987； Boudko et al. 2001)，但是电势测定的结果比指示剂方法更精确。由于螨类体型极小，测定消化道范围 pH 唯一可用的方法是指示剂法。由于螨类身体极小且透明可使用染色法并利用化学染色剂直接测定定中肠 的 pH 值。这个方法曾用几个 pH 指示剂如石蕊、酚红、通用
6、指示 剂、中性红确定中肠的生理 pH(Hughes 1950； Akimov and Barabanova 1976, 1978； Akimov 1985)。这是利用 18 种指示剂基于染色法首次对仓储螨及尘螨中肠 pH 的研究。 材料和方法 测试的 12 种螨， 包括 5 种粉螨 （粗足粉螨、椭圆板白螨、 Sancassania rodionovi Zachvatkin 、 (syn. Caloglyphus redickorzevi Zachvatkinand Caloglyphus hughesi Samsinak)、腐食酪螨、线嗜酪螨、
7、） ； 果螨 （甜果螨）、 嗜渣螨 （拱殖嗜渣螨）； 尘螨 （粉尘螨、户尘螨）； 食甜螨科 （ 家食甜螨，和 Aroglyphus robustus） 。这些螨类在捷克布拉格水稻研究学会实验室饲养（详细的饲养条件见 Erban 和 Hubert， 2008）。 指示剂的应用和螨类显微镜观察的制备 指示剂的选择是基于他们的 pT 和 /或 pKA 值及变色范围 (Holzbecher and Churacek 1987, Senese 2000, Shevchenko and Kulichenko 2005, Sabnis 2008)。所有的指示剂都购于 Sigma-Al
8、drich。所有的指示剂分为 6 组：（ 1） 确定 pH3-8 的指示剂 ：酚酞 (p KA = 9.1, 9.4, 9.53, 9.70； pT = 8.4-9.4； transition range = 8.3-10.0)、百里酚蓝 (pKA= 1.65； 8.90； pT = 2.6 and 8.4； transition range = 1.2-2.8 and 8.0-9.2)（ 2） 确定 pH 制接近 7 的指示剂 ：石蕊 (pKA= 7.00； pT = NF (not found)； transition range = 5.0-8.0)、苯酚红 (p KA = 7.9； p
9、T = 7.0； transition range = 6.8-8.2)、亮黄 (p KA = NF； pT = NF； transition range = 6.5-8.0)、溴百里酚蓝 (p KA= 7.0, 7.1； pT = 6.4； transition range = 6.0-7.6)；（ 3） 确定中肠 碱性 限值 的是溴苯酚红 (p KA = 6.51； pT = 6.16； transition range = 5.2-6.8)和氯酚红 (p KA= 6.00； pT = 6.00； transition range =4.8-6.4)；（ 4） 确定
10、中肠 pH 低（酸）限的是溴苯酚蓝 p KA= 4.0, 3.85, 3.6； pT = 4.0； transition range = 3.0-4.6)、茜草色素 (p K A= 4.5； pT = NF； transition range = 3.5-6.5)、甲基橙 (p KA= 3.76, 3.40； pT = 4.0； transition range = 3.0-4.4)、刚果红 (p KA = 4.1； pT = NF； transition range = 3.0-5.0)；（ 5）在酸性限制级碱性限制范围内进一步精确确定 pH 的是甲基红 (p KA= 5.06, 2.3,
11、2.5, 4.95； pT = 4.80； transition range = 4.4-6.2)、刃天青 (p KA= 6.71； pT = NF； transition range = 3.8-6.5)、溴甲酚绿 (p KA= 4.7, 4.6； pT = 4.66； transition range = 3.8-5.4)；（ 6）通用酸碱指示剂（ UABI） UABI 3-10(transition range = 3.0-10.0)、 UABI 0-5、 UABI 4-10(transition range = 4.0-10.0)。 将指示剂溶解在水或水 -乙醇溶液中，混入
12、小麦中获得终浓度 2%（ wt/wt）的指示剂。利用振荡器混匀湿的富含指示剂的饲料，然后置于密封的玻璃管中冻干 (Heto PowerDry LL3000, Thermo Fisher Scientific, )。每个 1.5ml 离心管中放入约 5mg 粉末 ,加入至少 50 个样本。每个管中加入一张湿滤纸。间隔 24,48,72 小时螨被转移到玻璃有盖培养皿。在螨分散后，在解剖显微镜下用毛笔收集摄取指示剂的样本。在用光学显微镜观察前用生理盐水（ 0.9%Nacl）洗涤螨外部的饲料碎渣。 螨中肠的显微观察 在 Axioskop 复合显微镜利用 Axiov
13、ison 软件和 powershotA620 数码相机下观察中肠颜色的变化。每个最小的方案每个物种每种指示剂包括 10 个阳性观察。不同于组织学研究，中结肠不能够 在观察中被识别出来。此研究中，除了中结肠外，确定了前胃、盲肠、结肠和后结肠的颜色变化（纤细的肠道解剖图，见图 1）。染料颜色的在肠道内腔的变化进行考虑，省略食物和粪便沸腾物（获得高浓度指示剂）。为了产生颜色对照，颜色指示剂溶解于 Britton Robinson 缓冲液 I。这个过程精细到 0.1pH 单位，颜色的改变与显微镜观察的颜色的改变进行比较。 结果 未喂食指示剂食物的螨类的身体是透明的。摄取指示剂的
14、螨中肠颜色改变。（表 1） 确定 pH3-8 之间的指示剂 酚酞始终是无色的，与没有指示剂的观察结果一样。百里酚蓝始终 是黄色的，没有例外的。 确定 pH 值接近 7 的指示剂 除了红色石蕊和苯酚红染色的红色后结肠外，在所有案例中指示剂显示出黄色。颜色变化证实中肠的 pH 大部分低于 6.5。在所以物种试验中苯酚红在后结肠的染色具有种间不同。证明在一些螨类中后结肠的 pH 约 7。 确定中肠 PH 碱性 限制的指示剂 这组指示剂的 pH 范围的上限是 6.0。中文指示剂的共同显示了所有测试螨类的盲肠和前胃 PH 低于 6。
15、在结肠和后结肠，被观察到为红色，从结肠到后结肠红色显著增加。只有尘螨和 A.robustus 显示整个颜色都是黄色。 确定中肠酸限的指示剂 基本上 ，指示剂颜色的改变证实在 mesodeal 腔的 pH 高于 4。盲肠、前胃、结肠被溴苯酚蓝染成蓝色。然而，在表皮尘螨属中两种螨中不同，被染成黄色和绿色。在样本 T. lini 中，在前胃和盲肠中被染成绿 /蓝色。甲基橙和刚果红（图 2A）在所有测试物种中的所有mesodeal 隔室中产生相同的颜色。在整个中肠中甲基红产生黄色，刚果红产生红色。茜素红 S 产生红或者黄色染色的中肠，与其他染色剂不一致。 在酸或碱限制内确定 pH 更为精确的指示剂 甲基红为红色时证实 pH 低于 5，为黄色时 pH 高于 5. 甲基红为红色时证实 pH 低于 5，为黄色时 pH 高于 5.被甲基红染成红色的盲肠的胃被证实 pH 低于 5。另一方面，结肠为黄色，说明 pH 高于 5。黄色的后结肠证明 pH 高于 6。这是基于甲基红的变色范围（ 4.4-6.2）且 PH 低于 6.2 时不会出现黄色的基础上。甲基红很好的说明了整个中肠从中间酸性盲肠、前胃到中性的后结肠的 pH 梯度。在这些范围内，刃天青的颜色从橙色到紫罗兰变化。基于
