1、 PDF外文： http:/ 1 中文 7630 字 出处： Water research, 2002, 36(2): 403-412 附录一 使用聚合酶链反应变性梯度凝胶电泳法测定不同电子受体条件下的反硝化聚磷菌的特征 Johwan Ahn, Tomotaka Daidou, Satoshi Tsuneda, Akira Hirata 化学工程学系 ,早稻田大学 ,3-4-1 Ohkubo,东京新宿 ,东京 169 - 8555,日本 2000 年 6 月 15 日接收； 2001 年 1
2、月 4 日接收修订版； 2001 年 4 月 17 正式收录 摘要 为了调查反 硝化聚磷菌（ DNPAOs）的特点以及微生物多样性，能够使用硝酸盐作为电子受体进行强化生物除磷（ EBPR），三序批式反应器都工作在三个不同的电子受体条件，即只有氧气，氧气和硝酸盐以及只有硝酸盐。根据关于每个反应器中的生物化学转化的化学分析，人们发现，负责强化生物除磷的聚磷微生物包含至少有三个种群包括 DNPAOs，并根据微生物群落结构改变电子受体条件。此外，与氧及硝酸盐培养的污泥在缺氧条件下的磷摄取量呈急剧增加，这表明在有氧条件存在一定比例的 DNPAOs 能够利用硝酸盐
3、。 另一方面，微生物群落结构依靠不同的电子受 体而改变已经通过变性梯度凝胶电泳聚合酶链反应扩增 16S 核糖体 DNA 片段的结果的分析得到证明。结果发现，包含在所有的反应器中的细菌通常是 Rhodocyclus sp.（ 96同源性）和 Dechlorimonas sp.（ 97的同源性），基于从 DGGE 条带切下的序列及测定亲缘关系的分析得出，它们属于 -Proteobacteria。然而，在所有的反应器中只有 Rhodocyclus sp.的存在被荧光原位杂交分析所证明。 2002 爱思唯尔科技有限公司保留所有权利。
4、2 关键词 : 16s 核糖体 DNA；变性梯度凝胶电 泳 (DGGE)；反硝化聚磷菌 (DNPAOs)；强化生物除磷 (EBPR)；荧光原位杂交 (FISH)；聚磷菌 (PAOs)；聚合酶链反应 (PCR) 1. 介绍 在过去几十年，生物脱氮除磷 (BNR)法被广泛用于处理废水中含有的营养物质 ,即氮和磷 ,以及化学需氧量 (COD),因为与化学处理方法相比它有经济优势。由于磷是限制藻类大量繁殖的养分，以聚磷菌（ PAOs）为特点的强化生物除磷（ EBPR）工艺一直被视为防止水体富营养化一种手段。然而， EBPR 工艺与生物脱氮工艺比有一个缺点，因为 CO
5、D 在低 C / N比时作为磷的释放和反 硝化作用的一个限制因素。 如果是这样的话 ,最合适的解决关于 COD 的限制影响的方案是将反硝化聚磷菌 (DNPAOs)引入到 BNR 过程 ,这样能够利用硝酸盐作为电子受体来同时去除废水中的磷和氮 1 - 6。在 BNR过程使用 DNPAOs的另一个优势是使用硝酸盐而不是氧作为电子受体结果是更少数量的污泥产生以及有效地利用 COD 因此，硝酸盐，产生有氧条件下的硝化过程中，已被认为是另一个电子受体用于同时去除氮和磷而无需额外补充的细胞外碳基质 7。 最近 ,为了考虑能够通过使用硝酸盐缺氧吸磷代替氧作为电子接受体的 PAOs 的
6、比 例， 在 DNPAO s 的反硝化活动中引入活性污泥模型 (ASM)NO.2 d 的 IAWQ 任务组 8。然而 , 一个从微生物的角度详细了解 DNPAOs 是缺乏的。这是主要是因为在 EBPR 技术中参与关键化学转化反应的 DNPAOs 目前为止还不能使用传统培养技术来培养。几个研究报告称 , 通过几个分子技术检测到 PAOs 属于 -Proteobacteria 9 - 13。然而 ,这些研究仅限于 PAOs 高磷 -在厌氧 /好氧积累能力条件。 因此 ,为确定 在 EBPR 工艺过程中负责缺氧除磷的 DNPAOs,我们采用聚合酶链反应 (PCR)变性梯度凝胶
7、电泳 (DGGE)法，该法已被广泛认为是研究微生物生态学的一个强大工具。 变性梯度凝胶电泳法是基于在电泳的 PCR 扩增 16 s 核糖体 DNA(rDNA)在聚丙烯酰胺凝胶碎片中含有一个线性增加变性梯度 14。不同的 DGGE 条带是分离的，根据具有相同长度但不同序列的 PCR 产物的融化行为，分别对应相应的物种。因此 ,PCR-DGGE 测定允许我们分析一个给定系统的微生物组成和多样性而不需要分离单个物种 15,16。这是特别有效的分析非可培养环境的微生物群落结构样品如 EBPR 工艺中的微生物。 此外 , 从 DGGE 凝胶切除的条带的序列分析提供了一个基础的凝胶
8、系统识别相应的细菌对应的条带以及 16 s 3 ribosomal RNA (rRNA)的设计有针对性的寡核苷酸探针荧光原位杂交 (FISH)分析 ,即使这些细菌是非可培养的。 本研究的目的是表征不同电子受体栽培条件下的 DNPAOs,在此基础上 , 采用 PCR-DGGE和 FISH 法分析微生物群落结构、亲缘关系的改变和识别执行生物除磷的 DNPAOs。 2. 材料和方法 2.1. 反应器运行 三个序批式反应器（ SBRS）各 1.0 L 工作容积，提供了三种不同的电子受体，即，氧气和硝酸盐 （ RA
9、N 反应器），无硝酸盐（ RAA 的反应器），仅硝酸盐（ RNN 反应器），分别运行了 30 天获得负责生物除磷的 PAOs。如表 1 所示， RAN 和 RAA 的反应器在厌氧 /好氧条件下运行，而 RNN 反应器在厌氧 /缺氧条件下运行。 在运行反应器之前，从东京一个市政污水处理厂好氧反应池取出的活性污泥是接种过的。在接种之前，这些污泥的缺氧吸磷能力采用硝酸盐作为电子受体进行了评估。其结果是，总有机碳（ TOC）被完全吸收并且磷在厌氧条件下释放，且在随后的缺氧条件下观察到，磷吸收利用硝酸盐作为电子受体。 所有的反应器运行周期为 8 h,包括一个 20 分钟填充阶段 ,90 分钟厌氧阶段 ,315 分钟有氧或缺氧阶段 ,30 分钟沉降阶段和 25 分钟退出阶段。一个周期后 ,0.5 L 的流出量与相同数量的入流量交换 ,因此保持 16 h 的水力停留时间 (HRT)。在一个循环结束时，为维持平均20 天细胞停留时间（ MCRT）， 17mL 剩余活性污泥浪费了。在整运行期间， pH 值维持在 6.9和 7.1 之间。在此研究期间有关组件定期计量，监测生物除磷性能。 表 1
