1、 PDF外文：http:/ 本科毕业论文 （或设计） 外文翻译 中文 7100 字 本科毕业论文 (设计 ) 外文翻译
2、; &nbs
3、p; 题 目 关于柑橘青果病
4、的两种韧皮部杆菌的 PCR 检测 本科毕业论文 （或设计） 外文翻译 1 关于柑橘青果病的两种韧皮部杆菌的 PCR 检测 原 文来源： Sandrine J
5、agoueix,Joseph Maric Bove,Monique Garnier.PCR detection of twoCandidatusliberobacter species associated with greeing disease of citrus.Molecular and Cellular Probes,1996,10:43 50 桑德里 .乔格 ，约瑟夫 .玛丽波维 ，莫里库 .卡利 （ 法国 波尔多第二大学 国家农业研究院 细胞分子生物实验室 ） 摘 要 ： 青果病是 柑橘上一种严重的并且广泛传播的病害，在世界范围内
6、有两个主要柑橘生产区域亚洲和非洲。它是由一种 难以分离和培养的韧皮部杆菌引起的，目前是从核糖体 DNA 序列来鉴别出来。 该 病菌是 属于 韧皮部杆菌属难培养的新种类 ，在变形菌门的阿尔法部分上，这两种病菌可以被鉴别出来，即亚洲株系和非洲株系 。 在这篇论文里，我们通过 PCR 方法扩增 16SrDNA1160bp 序列片段，来检测柑橘树上的两种病菌，分辨出两者之间的差别和 获得扩增后的提取物 。 关键词： 柑橘青果病，韧皮部杆菌， 16SrDNA,PCR 诊断 前 言 青果病 是柑橘树上危 害 严重和广泛传播的 病
7、害，分布在东亚（从巴基斯坦到中国），南非和东非，阿拉伯半岛和 印度洋海域的 留尼旺岛 ，毛里求斯和 马达加斯加 。由于昆虫媒介可以携 带 这种 病菌，所以这种病害威胁着其他柑橘种植区域（像美洲和地中海国家），例如 柑橘木虱、非洲木虱相继在南美和大西洋岛出现。 青果病是由一种韧皮部限制性细菌引起的， 由于这种细菌难培养，当前把它作为一个特征 。 这种可以被定义但难以培养的属名称为韧皮部杆菌属，默里和肖勒夫把它定义为难培养的有机体，并且归属于细菌类。我们也发现 亚洲韧皮部杆菌和非洲韧皮部杆菌属于两种不同的菌系 ：亚洲菌系和非洲菌系。两种 DNA 探针 ： I
8、N-2.6 和 AS-1.7 包含 核糖体蛋白质 的 基因（ 称作 -操纵子，知道其片段结构和大小） ，分别由亚洲菌系和非洲菌系制备的。通常 圆点印迹 杂交化验法 ，可以在感染的柑橘果园里采集柑橘叶片样片，分别检测青果病病菌种类。杂交化验法的灵敏度和电子显微镜相近，这是一种适用于早期的检测方法。 用两种不同的探针来检测两种不同的韧皮部杆菌很有必要（韧皮部杆菌在阿拉伯半岛和 留尼旺岛 ，毛里求斯岛这些地方都相继发现过） 实际上，抽 提 DNA 进行圆点印迹 法能让我们在很短时间内迅速的进入下一 步骤 。 PCR是一种简单、快捷和灵敏的方法，的确如此， 我们
9、把它作为早期 DNA 克隆的目的，得到亚洲菌系和非洲菌系的 16SrDNA 的基因序列。通过基因序列比较分析，模板和扩增的韧皮部杆菌的核糖体 DNA 有明显的相同部分。在这篇论文里， 我们研究最初细菌的特异性，必须要求 扩增从柑橘叶片中抽提的韧皮部杆菌属的 rDNA。上面的扩增片段中，可以用扩增 DNA 的限制性内切酶来区分不同的韧皮部杆菌的种类。 1.材料和方法 &nbs
10、p; 本科毕业论文 （或设计） 外文翻译 2 1.1 植物材料 长春花 （蔷薇属）和甜橙（柑橘科），均受到亚洲菌系和非洲菌系的两种不同病菌的感染，并体现初 出 早期的症状。这两类植物，其中感染亚洲菌系的主要放置在白天 30和晚上 25的温室中； 感染非洲菌系的放置在白天 25和晚上 20的温室中；另外健康的长春花和柑橘植物通过播种，在 25/ 20的温室里生长获得。 1.2 提
11、 取 植物中的 DNA 使用 默里和汤普生提出的 常规 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法来 抽 提 DNA。 提取柑橘叶片研磨液，准备 PCR。 1.2.1 方法 1： 取 0.5g 的叶片中脉，用刀片切成细小的碎片放在一个碟状的可使用的研钵中，加入 1ml 的 0.3M NaCl。研磨成浆液状态，用注射器收 集 进行 100g 的低速离心 时，进行离心。 PCR 既可以直接在 10 折至 100 折的稀释的悬浮液上完成，也可以在 悬浮液以 16000g离心 5min 后形成的沉淀物 和 用 100u
12、l 灭菌水的稀释液上进行 。 1.2.2 方法 2： 取叶片中脉（大约 0.1g 至 0.3g） ，用刀片切成细小的碎片放在一个碟状的可使用的研钵中，加入 1ml 的 TE 缓冲液（ 10mM Tris PH 8.0,400 mM EDTA,1%SDS） ,另外加入0.25mg 蛋白酶 K。 将研磨成浆液转移到 Eppendorf 离心管中，在 65情况下孵化 2h。悬浮液 12000g 情况下离心 15min，混入 1ml 的引物 DNA 净化树脂。这树脂转 变成圆 柱体 ，然后用 2ml 80%的异丙醇洗涤两次 ，接着加入 5
13、0ul 热水（ 80）， 1min 后，这个 Eppendorf离心管的圆状物在 16000g 情况下离心 30s。重复该步骤，取出 100ul 清液（导出液） ，取两个 10ul 的导出液 分别用作 PCR。 2.PCR 扩增反应 普通引物 Fd1 和 rP1 被用作常规的原核 生物 16SrDNA 的扩增 ； 引 物 OI2c 和 OI1，用为亚洲菌系（印度浦那品种） 16SrDNA 的扩增 ； 引 物 OA1 用作非洲菌系（南非的内尔斯普雷 特品种）的 16SrDNA 的扩增， 引 物 OI1 同样可以用作扩增非洲菌系，除了有三个基本的变化。因而它们
14、用来作韧皮部杆菌的 16sDNA 的特异性扩增。 PCR 反应是在 50ul 的混合溶液中进行的 ，其中含有 0.5 M 的底物、 200 M 的 三磷酸脱氧腺苷 、 78mM 的 Tris-HCL（ PH 8.8） 、 2 mM MgCl2、 17 mM (NH4)2SO4、 10 mM -巯基乙醇、 0.05% W1 去垢剂、200 g/mlBSA（ Gibco 公司生产）还有 2.5U 的 Taq 聚合酶（ Gibco 公司生产） 。 温度循环器 可以调成以下系列步 骤来进行 PCR： 92 30s、 54 30s 和 72 6
15、0s，循环 35 次，以 fD1/rP1为 引 物； 92 40s（变性）和 72 90s（退火和延伸），循环 35次，以 OI2c/OI1, OI2c/OA1 或者 OI2c/OI1/OA1 为 引 物。扩增反应结束后，用 8 L 反应混合液在 0.7%的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。 限制性内切酶分析扩增 DNA 片段 在最后，用 35 L 的量（根据制造厂商而定） 20U 的 Xba1 限制性内切酶来切割 8 L 扩增 DNA 片段，静置时间 为 一晚上。 这种切割的 DNA 片段通过 4%的琼脂糖 凝胶中进行电泳分析。 3.样品回收
