1、PDF外文：http:/ 4110字 出处： J Nat Med (2010) 64:182186 用 HPLCDADESIMS/MS方法对黄芪 抗病毒 活性部位 进行植物化学研究 Li Tang Ying Liu Yeing Wang Chunlin Lon 摘要： 黄芪在中国是一种用来治疗疾病的常用中草药 。 为了弄清黄芪的抗病毒成分，我们用 HPLCDADESIMS/MS分离和鉴定了黄芪提取物的几种抗病毒的活性成分。 通过比较已发表文献的
2、保留时间和 MS数据，共鉴定出 18个化合物 ，包括 11个黄酮和 7个皂苷类化合物。这个研究为快速鉴别传统中药的生物活性成分提供了一种途径。 关键词： 黄芪 抗病毒的 活性 黄酮 皂苷 前言： 中药广泛用于疾病的治疗， 为中华民族的繁荣和发展做出了 重要 贡献。 然而，它 的治疗机制却没有弄清。现在中药的 复杂成分和它的 有效性 相关的提法 被广泛接受。 因此，为了保证中药在临床上的可靠性，更好的 弄清 药物活性的基础并且提高产品的质量，阐明和分析中药的活性成分是很有必要的。 由于中药成分的复杂性使这一领域的
3、研究有很大挑战 性 。 因此，鉴别有效成分是很重要的。 现在，HPLCMSn已经 被证明是中药提取鉴定的一个有力工具。 这个 方法 在灵敏度和特异性方面有优势。 黄芪，是荚膜黄芪的干燥根，在中国叫做黄芪，是广为人知的一种补气药。 黄芪拥有许多生物学功能，包括保肝，抗氧化，抗病毒，抗高血压和刺激免疫应答 等 。 根据报道 黄芪 含有三萜皂苷，异黄酮类和多糖 等类成分 。在 这个研究 研究中，我们对黄芪的有抗炎活性的部分进行了植物化学成分的研究。 采用 HPLCDADESIMS/MS 技术 ， 比对已有化合物的 UV光谱和 MS数据 共 鉴别出 18个化合物，包括 11个黄酮类化合物和 7个皂苷类
4、化合物。 这个结果有助于 人们 对黄芪的临床 用药有更好的理解，并且有利于为这个传统 中 草药提供更好的质量控制方法。 材料和方法： 化学制品和试剂： 毛蕊异黄酮 -7-O- -D-吡喃葡萄糖苷 ,毛蕊异黄酮， 7-羟基 -4 -甲氧异黄酮 都已经从 荚膜 黄芪中分离得到。 标准品保存在我们实验室， 结构已经经氢谱和碳谱阐明 (一瓦里安 Mercury-Vx BB 器材 , 帕洛阿尔托 , 美国 , 300 MHz下测得氢谱 , 75 MHz 下获得 13C谱 )。 通过 HPLC检测纯度高于 95%。 黄芪甲甙 IV买自国家药品生物制品检定所（
5、北京，中华人民共和国）。 HPLC用乙腈从默克公司购买 。分析用乙醇和乙酸购自北京试剂有限公司。 D101大孔树脂购自中国天津树脂厂。 材料和样品准备： 黄芪在 2007年 12月北京同仁堂中药有限公司购得并且经作者进行了形态学鉴定。 植物经乙醇冷凝回流提取三次（每次两个小时）。 过滤和浓缩后，干浸膏用水再次溶解并且过 D101大 孔树脂柱。用水和 30%乙醇洗脱后用 70%乙醇再次洗脱 。 三次提取物用旋转蒸发仪减压浓缩。 和最开始的乙醇提取物一起，准备做抗病毒实验。 HPLCMS工具和条件： 分析用安捷伦 1100系列 MSD Trap sy
6、stem（安捷伦科技，帕洛阿尔托，加利福尼 亚州，美国），此系统装备了真空除气器， 四元泵，自动采样器，柱温箱，二极管阵列检测器，电喷射离子化接口的离子阱质谱仪， 用安捷伦 LC/MSD Trap软件控制， Zorbax SB-C18 (150 mm 4.6 mm i.d., 5 m)和 一个 Zorbax ODS-C18 预柱 (12.5 mm 4.6 mm i.d., 5 m)用来分离 。 流动相为水 -0.3%乙酸（ A）和乙腈（ B） .梯度洗脱： 030分，线性梯度 2060% B； 3035分，线性梯度 6020% B。 流速 0.8 ml/mi
7、n，柱温 25C。峰用 DAD检测 器 ，在阳离子模式下 检测 。质谱在质核比 100到 1500范围扫描。 为得到每个分析物的最大信号峰， MS条件选择如下：干 燥 氮气， 8l/min，毛细管温度 325C，喷雾器压力 30psi，毛细管电压， 15 V；离子喷射电压 3.5kV，待测物溶于甲醇中配制成 5mg/ml溶剂，在 12000 rpm条件下离心 15min， 在进样前去除颗粒状物。 细胞 和 病毒 : Hep-2细胞 在达尔伯克改良伊格尔培养基中培养。 该培养基中 含 2mmol/ L的谷氨酰胺， 100U/ml的青霉素，链霉素， 另 添加 10%胎牛血清 (中美合资
8、生 物技术公司 )。 培养基放在 37C， 5%CO2条件 的培养箱中。 副流感病毒，呼吸道合胞体病毒，单纯疱疹病毒 -1，单纯疱疹病毒 -2，腺病毒 -3和腺病毒 -7由 中国中药研究所，中药研究会提供。病毒在单层 Hep-2细胞 中繁殖并 储存在 -70C的冰箱中。 体外测定抗病毒活性： 被测成分用 DMSO溶解并浓缩到 10mg/ml。 工作溶液通过用 MEM双重连续稀释的方法准备好并加入到四个孔中， 200 l/well 。正常细胞做对照。四天的培养过程中，通过光学显微镜观察致细胞病变效应。通过 ReedMuench方法，黄芪的浓缩物 的 CC50被测定出来 。
9、 Hep-2细胞生长至汇合，在滴度 100 CCID50下被病毒感染。在 1.5小时长的病毒吸收期后，含病毒的介质换成新鲜介质，被测部位经过一系列的稀释同时加入到培养基中。 感染细胞不接受控制病毒的药物治疗。 当传染病后 48-96小时百分百的细胞病变效应被检测到后，能获得百分之五十的抑制 CPE的药物浓度 称为 半抑制浓度，通过三次 独立测 定 得 到 。 选择性指数，或者 CC50和 IC50的比也能计算被测部分的抗病毒活性。利巴韦林用做阳性对照。 抗病毒活性的生物测定方法： 抗副流感病毒活性测试用黄芪乙醇提取物和过 大孔树脂后的水， 30%乙醇和 70
10、%乙醇的洗脱部分。 四部分的半抑制浓度分别为 20.7 5.2, 135.2 4.6, 48.4 3.9, 和 15.8 1.2 g/ml。相应的四部分的选择性指数分别为 5.8 0.6, 1.5 0.4, 3.1 0.3和 8.5 0.6。 这表明 70%乙醇从 D101上的洗脱 的 部位是黄芪最有 抗病毒 活性的部分。 百分之七十部分的一系列的抗病毒活性列在表一中。 结果表明百分之七十的部位对呼吸道病毒，单纯疱疹病毒 -1，单纯疱疹病毒 -2有适度的活性。对腺病毒 -3， 腺病毒 -7和副流感病毒有重要的抑制活性。 结果表明百分之七十的部分是黄芪的抗病毒 活性的 基础。 &nb
11、sp;表 1 百分之七十部位在 Hep-2细胞中的抗病毒活性。 Virus 70%F Ribavirin IC50 (tg/ml) SI IC50 (tg/ml) SI Parainfluenza virus 14.1 1.1 8.5 0.6 77.3 5.8 9.4 0.7 Respiratory syncytial virus 57.1 5.6 2.1 0.2 113.7 8.5 6.4 0.4 Herpes simplex virus-1 41.4 4.7 2.9 0.3 143.3 5.8 5.1 0.2 Herpes simplex virus-2 42.8 4.1 2.8 0.3 128.3 4.5 5.7 0.2 Adenovirus-3 22.6 0.8 5.3 0.2 95.3 10.5 7.7 0.7 Adenovirus-7 15.7 0.9 7.6 0.5 85.7 4.0 8.5 0.4
