1、 代谢控制工程提高大肠杆菌番茄红素产量的研究 William R. Farmer and James C. Liao* 化学工程系，加利福尼亚大学，洛杉矶， CA 90034.*作者 (liaojucla.edu). 收稿日期： 1999.08.08，接受日期： 2000.02.22 摘要 代谢工程在复杂多样的宿主内产生外源代谢物方面取得了可喜的成果。但是代谢工程途径主要集中在扩大所需要的酶和解除细胞控制，因此没有被控制的代谢途径代谢失衡和不理想的产物出现。我们已经阐述了代谢工程的另一种进程，通过 设计调控回路使 调控子根据细胞内代谢的状态来调节基因表达 。尤其在大肠杆菌中恢复和改变调整回路体
2、系中的一个 Ntr 调控子来控制番茄红素的生物合成途径。被过量的糖分解刺激的人造的调控子， ACP 控制番茄红素中的两个关键酶的表达，这正响应了流体动力学。这样当减少因代谢失衡引起的消极影响时，细胞内操控系统就会明显提高番茄红素的产量。虽然我们论证这种可以提高代谢产量的方法，但是它也可被延伸到其他领域，而在这些领域中基因表达必须受细胞生理学严格的约束，如基因治疗。 关键词：类胡萝卜素，类异戊二烯，代谢工程，代谢控制，氮调控子 代谢工程在 上个世纪就被认为得益于对生物合成能力的充分理解，把向分析复杂生物资料和功能基因的学科进军作为进步的结果。这种知识的直接优势是允许合理的新颖的路径设计和排除先天
3、反应，而为了达到所需结果这种先天反应是不必要的或有害的。但是，随着代谢途径越来越有效，代谢工程将面临着一个新的挑战：即在这些路径中控制基因表达的调整层次流程的再设计。除了要构造代谢途径的遗传组成成分外，我们还要计划使他变得像基因表达路径动力学那样重要。 很多学者认为重组蛋白质或细胞路径的高水平感应现象将导致生长延迟和代谢活力的降低。这些表面特征有以下事 实产生：不断的产品需求高于改变细胞生长需求。我们希望这种普便情形能通过设计一个动力控制器有所减轻，当然这个动力控制器能够感受到细胞的代谢状态和控制重组细胞路径的表达。 被命名为代谢控制工程的这种方法包括重新设计原来的路径和将它们应用于重组细胞路
4、径。这样努力的目标是控制重组细胞路径的流量以适应细胞新陈代谢的状态。动力控制重组细胞路径可以潜在地导致产量提高、将生长阻碍减小到最小、减少有毒副产品形成。适应生理状态的基因表达规则对于基因治疗的成功也是十分必要的。这里我们举一个这种方法应用的例子 在大肠杆菌中提高番 茄红素的产量。 我们选择番茄红素作为典型例子是因为番茄红素对人类的健康有益。番茄红素作为一种有效的抗氧化剂，它 已经被提议治疗一些癌症和其他退行性疾病等，因此，具有活性的番茄红素的合成物和其它相关的类胡萝卜素已经越来越受人们的关注，并且有大量的报道在描述其产品。 结果和讨论 重组细胞路径构建动力学控制器 。 动力控制器的目的是用来
5、控制路径的流量以利于 C 和能量的利用。如图 1 所示：设计这样的一个细胞内操作系统需要识别器 : ( 1 )发信号分子反射相关代谢状态 （ 2）传感器监视信号 （ 3）控制器处理感觉的 输入 （ 4）控制阀（例如 : 促进器）调节基因表达（ 5）被控制路径的速度限制装置。 鉴别正确的信号分子和速度限制需要对代谢系统有一个彻底地了解。剩下的成分则由两种成分组成的调整体系衍生而来，其中这个体系包括大量的遗传调整分子。 图 1. 动力控制学描绘控制工程的结构图 被控制的过程是从葡萄糖到产物（番茄红素）和一些废品（例如：醋酸盐）的代谢途径。标准变量（或信号）是 ACP， ACP 提供信号让剩余的流量
6、变成废品。 感受分子是 NRI 蛋白 ,它可以结合在 DNA 上调节转录。控制阀是启动子 glnAp2，它可以在代谢控制系统中控制受限的进程（ Ldi and Pps）。图中虚线盒中指出代谢系统被控制。 我们最初的任务是鉴别一种可以放映细胞内代谢状态的信号分子和一种能够监控它的传感器。 ACP 可做为该代谢状态的信号分子，因为他已经被用来作为葡萄糖上的指示剂。另外，它也已经作为识别两种混合成分调节子的标准，如 Che13, Pho14, and Ntr15。提高 ACP 水平可以作为一种好的指示剂。因此，如图 1 所示我们的方法是使用 ACP 作为信号分子来控制酶在想得到的路径中的表达，同时也
7、充分地利用过多的 C 流量和改 变流量的方向以远离有毒产物醋酸盐。 为了理解 ACP和控制基因表达，我们利用大肠杆菌的 Ntr调节子（图 2）。 Ntr调节子可以让细胞适应氮不足的状态但是在大多数生物反应器下它的作用可以忽落，因为此时处于氮充足的环境下。 Ntr调节子自身的传感器叫 NRII,它是基因 glnL的产物，可以磷酸化的形式将磷酸转移给 NRI蛋白， NRIP进而与 AP2结合位点结合，启动 AP2的转译。在 NRII缺失时， NRI才能响应 ACP水平。设计 NRII缺失的回路控制，使 NRI对 ACP水平及目标基因表达做出响应（图 2A）。 为 了重建这种控制单位，我们限定在包含
8、 NRI粘合位点的区域和核 glnAp2启动子区域，并且插入 DNA片段到克隆载体。 NRI粘合位点重叠另一个被 cAMP-CRP调控的启动子 glnAP1。因此 DNA片段也包含 glnAP1，但是没有 cAMP-CRP粘合位点 (图 2A)。没有cAMP-CRP活性， glnAp2的活性相当低，并且包含启动子的信息构造一个野生型菌株（ JCL1595）来支持这个判断（图 2B）。 单一基因表达的动力控制 图 2. 动力学控制器的描述 （ A） glnAp2 启动子 在缺乏 NRII 时， ACP 可诱导 glnAp2。 NRI, NRI-粘合位点 ； glnAp2 核 , glnAp2 核
9、序列 ； RBS, glnA 核糖体粘合位点 ； ATG 转化开始。标注 “-35” 和 “-10”区指出两条 RNA 聚合酶的位置，其中 RNA 聚合酶和上游的 glnAp2 启动子相接触。来自单一复制 glnAp2-lacZ 的 (B, C) -Gal 活性构造（ B）细胞密度（在 550nm的光学密度下）和（ C）在 JCL1595（ glnL+）以及 JCL 1596glnL)中的 醋酸盐分泌物。来自野生型 (D) -Gal activity 活性在葡萄糖有氧生长期间单一复制 Plac-lacZ和菌株 VJS632 的生长动力学。用符号（ ）代表细胞生长，（）代表 -gal 的活性，（
10、）代表细胞外的醋酸盐。 为了测试 作为产物表达动力控制器的 glnAp2的电位，我们引入 glnAp2-lacZ信使核糖核酸的融合技术即通过 噬菌体进入到 glnL宿主菌株 (JCL1596),同时测量 -gal活性的时间进程。这种菌株包含 glnL2001等位基因。如图 2 C所示：当 glnL宿主分泌醋酸盐集中时 glnAp2-gal活性增加，然而没 有启动子活性的感应现象被发现，当然也没有适应于同基因的野生型（ JCL1595）如（图 2B）示。因而 在 NRII缺失时， glnAp2能够对过量的碳流量做出响应，而过量的碳流量 可以被醋酸盐的排泄物反映出来。当细胞进入最后阶段时，生物合成需求减少，细胞开始层现出过量的碳流量。在这时，glnAp2-gal活性开始上升。相反在 野生型菌株（ JCL1595）中 glnAp2-gal活性相对降低，暗示出 glnAp2-lacZ表达被在 glnL菌株 (JCL1596)中的 ACP调控，而不是被 glnAp1
