1、外文原文：http:/ 中文 3483 字 海洋沉积物中产生的 L-谷氨酰胺酶的选择性分离和分子鉴定 Kiruthika J. 和 Saraswathy N. 1.政府科技学院， 哥印拜陀 -641013 ，泰米尔纳德邦，印度 2.库玛拉格鲁科技学院，哥印拜陀 -641049，泰米尔纳德邦，印度 出处： Research Journal of Biotechnolog
2、y Vol. 8 (8) August (2013) 摘要： L-谷氨酰胺酶（ L-谷氨酰胺水解酶 E.C.3.5.1.2）是一种催化 L-谷氨酰胺裂解成 L-谷氨酸和氨的酶。由于其潜在的应用作为抗癌和风味增强剂，它已经得到了重视。为了分离出一株有生产潜力的 L-谷氨酰胺酶菌株，印度喀拉拉邦和泰米尔纳德邦不同河岸的土壤样品被收集起来。几株菌种中，基于酶的活性，一株有效的分离菌被选择和确定了下来。 形态学和生化特征显示，有效的分离菌属于弧菌属。此外，有效菌株的 16s rRNA基因（ 1.4Kbp）被扩增，分析表明大约有 99%的相似性弧菌。 IMSF-06
3、（ NCBI 登录号GQ907023）和下一个同源性弧菌是 Azureus； HNS029（ NCBI 登 录号 JN128263）。因此，该菌株最终鉴定为弧菌 Azureus JK 79 菌株（ GenBank 登录号 JQ820323）。 关键词： L-谷氨酰胺酶，分离，鉴定， 16s rDNA 序列分析，弧菌 Azureus JK 79。 引言 L-谷氨酰胺酶（ L-谷氨酰胺水解酶 E.C. 3.5.1.2）催化谷氨酰胺水解成 L-谷氨酸和氨。它是各种含氮代谢中间体合成的关键酶。 L-谷氨酰胺酶是由不同的细
4、菌，真菌，酵母，霉菌和丝状真菌合成的。 这种酶参与微生物的谷氨酰胺代谢。哺乳动物也合成这种参与到以谷氨酰胺为主要呼吸 燃料产生能量的酶。因此，许多类型的肿瘤细胞以及积极分裂的正常细胞表现出对谷氨酰胺高几率的利用。 癌细胞，尤其是淋巴肿瘤细胞不能合成 L-谷氨酰胺，因此需要大量的谷氨酰胺来使它们快速生长。因此，这些癌细胞依赖于谷氨酰胺的外源供应来生存和细胞快速分裂。因此，酰胺酶的使用剥夺了肿瘤细胞所需要的 L-谷氨酰胺并且导致了 L-谷氨酰胺依赖性肿瘤细胞的选择性死亡。 L-天冬酰胺酶和 L-谷氨酰胺酶由于其抗肿瘤的特性获得关注。陆生的 L-天冬酰胺酶细菌源目前被用于治疗白血病，但是
5、这个众所周知会导致很多副作用，因此，有必要找一种替代的 更兼容人血并且减少或者对患者没有副作用的酶药物。海洋环境，尤其是海水，在化学本质上接近人类的血液，当人体在治疗应用中可以提供安全较少或没有副作用的微生物酶。 另一个关于海洋微生物酶重要的事实是，他们表现出高水平的耐盐性。因此，为了治疗目的对海洋微生物有越来越大的兴趣。 L-谷氨酰胺酶的另一个重要的应用是在食品行业作为风味增强剂。它增加了发酵食品中谷氨酸的含量，具有独特的风味。由于 L-谷氨酰胺酶的来源是有限的，对于潜在的新特性高产的工业生产菌株的搜寻正在全世界进行着。 任何微生物的生物产品的筛选包括从生态位点 (土
6、壤和水）的样品采集，跟随着微生物样品的筛选或者已经可用的微生物菌株筛选。寻找新的微生物酶来源的最有效方式是根据其多样性和通用性来筛选大量微生物。通过形态学和生化特性的细菌鉴定是一项艰巨的任务，它是耗时的，也伴随着许多困难， 由于在不同环境中生长的同一菌株的生理生化特性差异。一个 16s rRNA 的测序和伯杰系统细菌学手册的生物体的生化特性相结合的方法目前被用于权威的细菌鉴定。 在本研究中，我们描述一个有效的海洋细菌菌株生产 L-谷氨酰胺酶的高选择性分离。新菌株的分子鉴定是通过 16s rDNA 的序列分析 。 材料和方法 样
7、品采集： 土壤样品从泰米尔纳德邦和喀拉拉邦的不同河岸收集，用无菌聚乙烯袋包装和运送到实验室。样品储存在 4到进一步的使用。 L-谷氨酰胺酶的分离富集与筛选： 一克土壤样品悬浮在 100毫升的水，让它在孵化器和振动混合井（ 100转， 37）对土壤沉积物完全混合 30分钟。约 1毫升的上清液稀释在无菌海水和 0.1毫升铺在最小的谷氨酰胺琼脂（ MGA）培养基上面。 MGA 的成分（克升）包括 0.5的氯化钾； 0.5硫酸镁； 1磷酸二氢钾； 0.1硫酸亚铁； 0.1硫酸锌； 10的谷氨酰胺， 0.12苯酚红与放线菌酮（ 20 克 /毫升）。 L-谷氨酰胺作为唯一的碳源和氮源，酚红作为
8、 pH 指示剂和抗生素的放线菌酮抑制真菌生长。平板在 37下培育 48小时。 只有合成 L-谷氨酰胺酶的细菌能生长在 MGA 培养基上，细胞外产生的 L-谷氨酰胺酶在粉色菌落周围形成区被发现。单菌落被选择并且培育在谷氨酰胺琼脂培养基内。目前工作中的所有培养基都和含有 3盐的海水混合制备了。十七种形态不同的菌株被选择并且 L-谷氨酰胺酶活性被测定。 酶的测定： 对 17种菌株，通过 Imada et al 方法测定 L-谷氨酰胺酶的活性。不同菌株在 37和 180转下培养 24小时 然后放在 10000转离心机上离心 20分钟，取上清液用于酶测定。 0.5毫升的样品和 0
9、.5毫升 0.4M 的 L-谷氨酰胺溶液等分混合在 0.5毫升蒸馏水和 0.5毫升的磷酸缓冲液中。该混合物在 37下反应 30分钟，反应完后加入 0.5毫升 1.5M 的三氯乙酸。 0.1毫升混合物中，加入 3.7毫升蒸馏水和 0.2毫升的内斯勒氏试剂。 吸光度测量在 450nm 处用紫外可见分光光度计。释放的氨含量的测定和一个国际单位的 L-谷氨酰胺酶被定义为在最佳条件下释放 1微摩尔氨所需要的酶量。酶的产率表示为单 位 /毫升（ U /毫升）。 表型和生化鉴定： 形态分析，如纹理，颜色和强有力的设计边缘被确定。生化特性试验是根据伯杰系统细菌学手册进行的。 分离株的分子特征： 基因组的 DNA 通过使用铬的基因组 DNA 提取试剂盒（ RKT09)从培养的 Est 1菌株中被分离并且步骤是根据制造协议进行的 .引物 16s FP 5'-AGAGTRTGATCMTYGCTWAC-3' 和 16s RP 5'- CGYTAMCTTWTTACGRCT-3'被用来扩增1.4 kbp 的 16s rDNA 基因。 PCR 初始变性在 94下进行 5分钟，然后在 94 进行 35个周期的 30秒变性， 55退火 30秒， 72扩增 2分钟，最后使用热循环仪 ABI2720在 72扩增 5分钟。
