1、 PDF外文：http:/ 毕业设计（论文）外文译文 学生姓名： 学号： 专业名称：生物工程 译文标题（中英文）： Application of real-time PCR to monitor population dynamics of defined mixed cultures of moderate thermophiles involved in bioleaching of chalcopyrite(运 用实时 PCR技术监测生物浸出黄铜矿中的嗜热微生物的数量 ) 译文出处： Appl Mi
2、crobiol Biotechnol (2009) 81:1161 1168 DOI 10.1007/s00253-008-1792-8 指导教师审阅 签名 ： 外文译文正文 ： 运用实时 PCR 技术监测生物浸出黄铜矿中的嗜热微生物的数量 摘要 ：为了比较由不同比例温和嗜酸的细菌氧化黄铜矿氧化溶出率，由三种细菌混合培养：嗜酸 caldus s2 中端螺旋菌嗜铁钩端螺旋菌 YSK，和 Sulfobacillus 藻。用 LN 和一个古菌
3、 Ferroplasma 摇瓶培养在 45孵育。黄铜矿溶解度可以通过测量可溶性铜，三价铁， 和 pH 变化值。微生物在生物浸出中的数量动态监测过程中采用实时定量聚合酶链反应（ PCR）技术。所有这些中，发现复杂混合物同时包含自养（属嗜铁钩端螺旋菌和 AT。 caldus）和 chemomixotrophic（ Sulfobacillus 和 F.）的效果是最好的。嗜热嗜酸温和细菌生理之间的互惠明显，涉及铁、硫转变和有机复合转移，被认为是在促进黄铜矿溶解中发挥了关键作用。实时 PCR 检测方法是可靠的分析中度嗜热微生物种群动态的生物浸出系统，以及分析结果是与这些菌株的生理特征一至的。
4、 关键词 ：中度嗜热嗜酸，生物浸出，黄 铜矿，种群动态，实时 PCR。 引言 用嗜酸性微生物从矿石中溶出金属部分和随后的恢复金属形式的解决方案被称为生物浸出（ Rohwerder 等人。 2003 年）。黄铜矿（ CuFeS2）是最丰富，含有耐火材料的硫化铜，因此生物浸出的铜矿是关键的工业目标。而大多数研究主要集中在嗜温微生物的应用，包括氧化亚铁硫杆菌的，端螺旋菌杆菌和嗜酸硫杆菌，在 25-40 的成长最佳，而在此温度下黄铜矿生物浸出范围低溶解率（沃特林 2006）。近年来，一些研究（戈贝尔和 Stackebrandt 1994；诺
5、里斯等。 2000 年罗林斯 等。 1999 年 ；霍克斯等。 2006年）曾建议，端螺旋菌属， caldus， Sufobacillus 菌。，和 Ferroplasma cupricumulans 在生物浸出系统操作在 45-50C 间， 对 矿石溶解发挥了重要作用 。一个数据研究还表明，在高温条件下，溶铜从矿石中溶解更有效（露等人。 2000 年 ；拉姆等人。 2002 年）。 如今，出现对应用浸出矿物硫化物在混合培养 40-50 C 和微生物群落分析，表现出越来越大的兴趣(Okibe et al.2003； Ok
6、ibe and Johnson 2004)。 Okibe 等。 （ 2003 年）分析了三地的菌群在搅拌缸中搅拌，多金属氧化集中在 45 C，和菌群由三个菌组成（ At. caldus，藻端螺旋菌。，和 Sulfobacillus藻。）和一个古菌（ Ferroplasma 藻。）我们还发现，从矿山酸性排水中富集的温和的嗜热微生物有类似的群落结构。上述结果表明，这些简单的社区可以很容易地构建。黄铁矿氧化溶解（硫化铁），定义为由 7种中度嗜热菌的组合（ MT6 端螺旋菌， Acidimicrobium 硫杆菌，在。 caldus，脂环 Y004， 3 Sulfobacill
7、us属。） 和一个古菌（ Ferroplasma MT17）的研究（冲部和约翰逊 2004 年）。但是，仅有少数报告对黄铜矿生物浸出定义为中度嗜热嗜酸微生物的群落。因此，应努力把重点放在用中度嗜热嗜酸细菌构建有效菌群用于生物浸出黄铜矿。此外，在黄铜矿浸出系统中微生物的传代，以及如何传代影响矿物溶解过程，是了解得不够清楚，并应进行调。为了优化操作条件，提高浸出效率，有必要让温和的嗜热嗜酸最佳组合和监测反应温度， pH 值等参数，来反应这些微生物的种群动态。 限制性片段长度多态性，单链构象多样，变性梯度凝胶电泳被用来揭示浸出环境菌落 的结构（微生物 2 群落巴塔利亚，布吕内等人。 &n
8、bsp;2002年 ； Demergasso等。 2005年，迪亚比等人。 2007年）。然而，这些方法定量分析中都表现不佳。荧光原位杂交技术已成功地应用于测量生物浸出环境嗜酸细菌数量（冈萨雷斯 -托瑞尔等。， 2003年，冲部和约翰逊 2004年）。这种方法代表在分析浸矿微生物数量方面的一种重要进步，但它是耗费时间和人力。实时定量 PCR技术基于在线荧光 PCR产物检测，提供了一种快速，简单的方法来测量菌群中微生物种群并已成功地应用到测量细菌和古细菌硫化矿物浸出系统（刘等人。 2006年 ）。 这项工作的目标是，从各种混合中度嗜热嗜酸文化和监测黄铜矿生物浸出过程中的种
9、群动态采用实时定量 PCR技术来比较黄铜矿溶解效率。这项研究的结果可能提供资料的逻辑设计，对用人工构建中度嗜热嗜酸菌落，用于特殊矿物生物浸出硫化物有重要作用。 材料与方法 微生物和培养条件 中度嗜热嗜酸在此选择研究了在 caldus菌株 S2的（邱等人。 2007年），属嗜铁钩端螺旋菌菌株 YSK（镐等人。 2006年），嗜热号应变母语（周等人。 2008年），和 Sulfobacillus藻。 LN株根据他们已知的性能。我们的实验室的所有独 立菌株，被培养在一种激活的培养基中。微生物是生长在适当的液体培养基介质中45 C
10、，用来在混合菌剂使混合培养基中做生物浸出实验。 属嗜铁钩端螺旋菌 YSK生长在 9K培养基中，初始 pH值 1.6，和 Sulfobacillus藻。 LN的种植在与 1.5初始pH值中，补充 0.02（瓦特 / V）的酵母提取物。 caldus S2的是培养在 Starky basal salt 培养基中以硫的作为能源，初始 pH为 2.0。 9K培养基（克 /升）： (NH4)2SO4, 3；KCl, 0.1； K2HPO4, 0.5； MgSO4 7H2O, 0.5； Ca(NO3)2,0.01； FeSO4 7H2O, 44.7. Starky-S
11、medium (in g l 1):(NH4)2SO4, 3； KH2 PO4, 3； MgSO4 7H2O, 0.5；CaCl2 2H2O, 0.25； S, 10。 F. thermophilum L1接种于培养基中含有营养物质基础的（ g/L）： (NH4)2SO4,1.5； MgSO4 7H2O, 0.25； KH2PO4, 0.25；Na2SO4, 0.25； FeSO4 7H2O, 30，酵 母膏， 0.2。 生物浸出实验 X射线衍射仪（ XRD）分析矿物样品表明黄铜矿为主要组成部分（ 62.2）和硫化铅（ 25.8）是一引起少量的连同对斑铜矿（ Cu5Fe
12、S4）和闪锌矿（硫化锌）。化学样品的矿物组成为 20.13的铁， 28.49铜，和 27.36硫。被粉碎的矿物然后通过一个有 75微米孔径筛。 生物浸出试验，用 500毫升摇瓶含 200培养基在 45 C，初始 pH值 1.3，转速 170RPM的摇床中培养。 9K basal salts培养基不添加硫酸亚铁是用于黄铜矿生物浸出试验。矿石浓度为 2（ w/v）。 浸出实验每组三样。 在纯培养基中，通过离心和无菌水冲洗两次，用硫酸调整 pH值到 2.0，获得 At. caldus s2, L. ferriphilum YSK, F.thermophilum L
13、1, andSulfobacillus sp. LN等。然后，细胞悬浮在 9K培养基并且没有硫酸亚铁的溶液中，作为接种细菌。根据设计，数目相等细胞（约 1 107细胞毫升，每 1株），按顺序接种于摇瓶。定期分析样品中铜，总溶解铁，亚铁， pH值，以及菌落结构。 生物浸出实验，使用以下 5个菌落： 1、 caldus S2及属嗜 铁钩端螺旋菌 YSK ： 2、 caldus S2和嗜热号L1； 3、 caldus S2和嗜热楼一楼 0.02（瓦特 / V）的酵母提取物 ； 4、 caldus S2的湖嗜铁钩端螺旋菌 YSK和
14、 F.thermophilum 11； 5、 caldus S2的湖嗜铁钩端螺旋菌 YSK，嗜热号 L1和 Sulfobacillus菌。非生物控制也进行了设计。浸出实验持续了 28天。 理化分析 3 溶液中铜，铁的总浓度测定用原子吸收光谱法。亚铁铁浓度确定，用钾滴定重铬酸钾（ K2Cr2O7）。浸出系统的 pH值用 pH计进行测定。浸出残 渣过滤，洗涤，并用冷冻干燥 干燥，最后由 X射线衍射分析。培养瓶中细胞的密度的测定用 1细胞计数仪。 基因组 DNA提取 使用 TIANamp基因组 DNA纯化试剂盒（
15、Tiangen生物科技，有限公司，北京，中国）提取摇瓶种植中纯培养的微生物的 DNA。 在生物浸出样品中提取 DNA运用刘等人修改了协议。 （ 2006年）。固体（集中和自由的细胞）是从 5毫升的样本在 12000 g离心 10分钟提取基因组 DNA溶于 TE的 60微升（ 10 mM的的 Tris - HCl， pH值 8.0， 0.1 mM的 EDTA）的。 DNA的样本可视 化，与溴化乙锭染色后，电泳通过 1（瓦特 / V）的琼脂糖凝胶。用于 PCR目的，纯化的基因组 DNA的浓度用分光光度计测量使用 NanoDrop 钕 - 1000分光光度计（ N
16、anoDrop技术，威尔明顿，美国）和调整，以最终浓度 25 ng / l。 设计特异性 PCR引物 在 这 项 研 究 中 使 用 的 引 物 列 于 表 1 。引物 NR-R2,Acaldus-P1,Lfer-P1 刘 提 到 过 ， 引 物Fer-P1,Sacid-f,Sacid-R是用 Premier 5.0设计的。所有的引物由生工合成由 Sangon (Sangon Biological EngineeringTechnology & Services, Co., Ltd., Shanghai, China)进行。该特定的片段进行扩增，然后用 1.5琼
17、脂糖凝胶电泳检查和溴化乙锭染色，以确保 PCR产物即引物特异性和尺寸。 DNA序列由 Sangon 和 BLAST合成，并在 GenBank 分析检查产品。这些引物用实行实时定量 PCR进行了测试其是否符合实验的要求（见下文）。 PCR和实时 PCR 常规 PCR方法是用 T -梯度 Thermoblock（ Biometra，哥廷根，德国）。 PCR扩增 在 95下 5分钟，其次是35个循环的 95下 15秒， 55下 30s， 72下 30秒，最后一循环为 72下 7分钟。 PCR产物分析采用琼脂糖凝胶电泳，并在必要时，采用纯化用
18、 QIAquick自旋 PCR检测纯化试剂盒（ Qiagen公司，希尔登，德国）。对PCR的 DNA含量产品采用分光光度法测定 NanoDrop 钕 - 1000分光光度计。由于片段所有 16S rRNA基因长度分别为众所周知，数字 DNA进行直接计算出的浓度 PCR产物。将 PCR产物进行系列稀释从 103到 108份微每升和实时 PCR技术扩增建设标准曲线 。 实时 PCR技术运用了实时孔定量 PCR检测系统（生物拉德实验室公司，大力士，美国）。反应混合物中包含 25微升绿色荧光 SYBR 实时 PCR法师组合（东洋纺有限公司有限公司，大阪，日本），其中包含 Taq DNA聚合
19、酶， dNTP浓度，氯化镁，和 SYBR Green I的染料， 2 ul反义引物， 5微升模板 DNA，和添加 H2O定容到微升。还要设计阴性对照。实时 PCR技术方案包括一个 5分钟的 95循环，然后 95 C循环 15秒， 55下 30秒， 72下 30秒。在完成每次运行，融化的扩增曲线通过提高测量的温度从 55 C至 0.595 C，而监测荧光。该特异性 PCR扩增检查通过检查融化曲线的 Tm，它的对称性，以及缺乏非特异性山峰。全部都是一式三份进行测试。 结果 比较温和嗜热嗜酸在混合培养基黄铜矿浸出 混合培养中的温和嗜热嗜酸黄铜矿浸出的结果如图所示。第一在生物浸出中的铜的浸出率比在非生物控制实验（ 13.3）中的大很多。结果表明：不同温和嗜热微生物混合培养铜回收的比例不同后 28天。该
