1、 1 浙江师范大学本科毕业设计 (论文 )外文翻译译文 一 ： 柑桔属类胡萝卜素生物合成途径中七个基因拷贝数目及遗传多样性 的分析 Journal of AgricLtural and Food Chemistry. 2007, 55(18): 74057417. 摘要： 本文的首要目标是分析类胡萝卜素生物合成相关等位基因在发生变异柑橘属类胡萝卜素组分种间差异的潜在作用 ； 第二个目标是确定这些基因的拷贝数。本实验应用限制性片段长度多态性（ RFLP）和简单序列重复 （ SSR） 标记法对类胡萝卜素生物合成途径中的七个基因进行 了 分 析。用 R-32PdCTP标记 PSY， PDS， ZDS
2、，LCY-b， LCY-e， HY-b和 ZEP cDNA片段作为作探针，使用若干限制性内切酶对来自25种柑桔基因型基因组 DNA的限制性片段长度差异进行了分析。而对于 SSR标记，设计两对引物分别扩增 LCY-b和 HY-b基因的表达序列标签（ ESTs）。在这 7个基因中，LCY-b只有 1个拷贝，而 ZDS存在 3个拷贝。利用 RFLP和 SSR分析发现基因的遗传多样性与核心分子标记一致。 RFLP和 SSR对 PSY1， PDS1， LCY-b和 LCY-e14个基因的分析结果足以解释 这几个主要的商业栽培种的系统树起源。此外，我们的分析结果表明，不同种类柑橘中类胡萝卜素积累的番茄红素
3、环化酶 LCY-b和 LCY-e1等位基因存在种间差异。前人报道 PSY， HY-b和 ZEP基因与种间类胡萝卜素含量差异密切相关，但本实验发现这些等位基因并不起关键作用。 关键词： 柑桔；类胡萝卜素；生物合成基因；基因变异；系统发育 前言 类胡萝卜素是植物光合组织中普遍存在的一类色素。在色素蛋白复合体中，它们作为光敏元件进行光合作用，并且防止过强光照强度引起的 灼伤 ，并在园艺作物果实，根，或块茎色泽和营养品质上起着十分重 要的作用。事实上，其中一些微量营养素是维生素 A的前体，是人类和动物的饮食必不可少的组成部分。由于具有抗氧化性，类胡萝卜素在预防慢性疾病也发挥着重要的作用。类胡萝卜素生物
4、合成途径现在已经明确。类胡萝卜素通过核酸编码的蛋白酶在质体中合成。其直接前体是牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（ GGPP，该前体同时也是赤霉素，质体醌，叶绿素，维生素 K，维生素 E的前体）。在光合植物中， GGPP主要来源于 2-C-甲基 -D-赤藻糖醇-4-磷酸（ MEP）途径，两分子的 GGPP经八氢番茄红素合成酶 （ PSY） 催化缩合形成一个八氢番茄红素 15-顺式 -八氢番茄红素。八氢番茄红素经八氢番茄红素脱氢本科毕业设计（论文）外文翻译 2 酶（ PDS）和 -胡萝卜素脱氢酶（ ZDS）催化八氢番茄红素转换成红色的聚 - 顺式 -番茄红素。最近， Isaacson等和 Park等分别从番
5、茄和拟南芥中分离编码类胡萝卜素异构（ CRTISO）基因，该基因催化异构化聚顺式 -胡萝卜素进入全反式类胡萝卜素。CRTISO作用于番茄红素前体环化反应形成一种全反式番茄红素。植物番茄红素的环化有两条途径：一个分支合成 -胡萝卜素，另一个分支合成 -胡萝卜素。番茄红素 环化酶（ LCY-b）通过两个步骤转换成 -胡萝卜素，而形成的 -胡萝卜素的过程需要两种酶，番茄红素 -环化酶（ LCY-e）和番茄红素 环化酶（ LCY-b） 。 -胡萝卜素经 -胡萝卜素羟化酶（ HY-e）和 -胡萝卜素羟化酶（ HY-b）的羧基化催化作用转化为叶黄素。 -胡萝卜素经 HY-b的羟化反应催化和玉米黄质环氧化酶
6、 (ZEP）环氧化催化作用合成其他叶黄素。到目前为止，柑橘中大多数的类胡萝卜素生物合成的基因已被克隆和测序，但对柑橘类水果类胡萝卜素合成的复杂调控的认识仍然十分有限的，需要进一步了解柑橘中这些有差异的等位基因拷贝数，因为这些基因会影响柑橘类水果中最来源丰富的 类胡萝卜素组成。 果实类胡萝卜素的结构较为复杂，在柑橘类水果中已查明有 115种 不同的类胡萝卜素。柑橘果肉类胡萝卜素丰富程度取决于环境条件，特别是生长条件和地理环境。但影响类胡萝卜素质量变化的主要因素是遗传的多样性。 Kato等表明中国柑橘和橙汁积累高水平的 -隐黄质和紫黄质，成熟的柠檬积累低水平的类胡萝卜素。Goodnr等发现红西柚汁
7、含有两个主要类胡萝卜素：番茄红素和胡萝卜素。最近，我们对栽培变异柑桔品种类胡萝卜素组分含量不同从生物合成途径上进行了广泛的研究。根据是否含有不同的化合物将其分成三类：（ 1）中国（ 普通）柑桔，甜柑，酸橘；（ 2）蜜饯，柠檬，和酸橙；（ 3）柚和葡萄柚。我们的研究也明确了致使类胡萝卜素结构的多样关键步骤。在酸柑橘中八氢番茄红素合成是一个限制步骤；番茄红素形成 -胡萝卜素和 -胡萝卜素是被酸式磷酸盐限制在第三个分类中（柚和葡萄柚）；只有第 1组品种能够 合成 紫黄质。在同一研究中，以是否存在的类胡萝卜素（以下这种分类也被称为类胡萝卜素组织多样性）和遗传多样性评价为基础，我们认为应通过生化或分子分
8、子标记遗传多样行评估在种间一级组织 中的 多样性，类胡萝卜素的组成如同工酶或随机扩增多态性 DNA（ RAPD） 对大量的柑桔品种进行分类。 此外， 我们还得出结论认为，在种间水平，类胡萝卜素结构多样性和柑橘属的进化过程有关系，而不是突变事件或人为的甄选过程。事实上，在种间水平，在柑桔栽培历史上，表型变异和遗传多样性的关系具有普遍性和一般性，这和不能适应环境的不平衡相关联。因此，从数值分类的基础上，或从形态性状的分子标记分析，所有的研究者均认为：存在着三种基本分类 （ 宽皮桔类；中国柑桔；枸橼，蜜饯；文旦，柚 )，其差异是由于异域的演变。其他种植柑桔的品种 （ 甜橙类，甜桔；酸橙类，酸桔；柑橘
9、属葡萄柚，葡萄柚；柠檬类，柠檬 ） 是杂交的 结果，而酸橙类本科毕业设计（论文）外文翻译 3 则可能是佛手柚和薇甘菊的杂交种。先前研究柑桔演变的结果和数据使我们提出这样的假设：等位基因变异导致类胡萝卜素水平的结构差异，原因在于次级代谢产物的产生。这种分子变异可能有两种不同的影响：一方面，非沉默替换编码区影响生物合成途径相应酶的作用；另一方面，非编码区域的变化影响转录或转录后机制。 到目前为止，没有人研究过柑桔中类胡萝卜素生物合成途径的等位基因多样性。本实验的 目的 是为了研究基因变异是否部分决定种间水平表型变异性。为此，我们应用 RFLP分析了类胡萝卜素生物合成途径中的 7个基因（ PSY，
10、PDS， ZDS，LCY-b， LCY-e， HY-b， ZEP），以及两个 SSR序列分析一批有代表性品种的 LCY-b和 HY-b基因，旨在解决下列问题：（ a）这 7个基因是单基因还是多基因位点；（ b）RFLP法和 SSR标记法显示的差异性与栽培柑桔的记录一致，从而可以推论次级产物基因系统发生的起源。（ c）多样性与表型的（类胡萝卜素化合物）变化相关联。 结果与讨论 本实验应用 RFLP分析法来观察基因型样本的整体差异。用类胡萝卜素生物合成途径中的 7个主要基因的表达序列作为探针进行 RFLP分析，每一个基因用一个或两个限制性内切酶 ，筛选内含序列及酶切位点的基因组序列，以基因组 DN
11、A为模板PCR扩增和 酶切 PCR产物。结果表明没有一个 PDS和 LCY-b片段的内含子序列。在这两个片段克隆和序列分析相应的基因组序列中没有检查出内含序列（数据未显示）。相反，我们发现 PDS， ZDS， HY-b， ZEP和 LCY-e基因组含有 RFLP探针序列。 EcoRV并没切断 PDS， ZDS， HY-b， ZEP和 LCY-e基因组序列。以同样的方式，没有发现 PDS，ZDS和 HY-b的基因组序列的 BamHI酶切位点。表 4是对于不同基因多样性观察有关的数据。总共 58个片段被 确定，它们中的六个是单一同态的（存在于个体中）。三个基本分类单元的有限样本中， 58个之外只有
12、 8个条带不能被观察到。在基本分类单位，每个基因型 遗传距离 的平均数分别是，宽皮橘类 24.7， 中国柑橘 24.7， 柠檬类17这与次级物种的 28（酸橙类） 到 36（ 橙类 ） 不同。每个基本的分类单元个体 RFLP条带的平均数均低于次级物种类群。结果表明次级物种比基于三个基因分类的基本物种更加杂合。这是合理的如果我们假设次级物种起源于三个基本分类，此外经RFLP围绕类胡萝卜素生物合成途径的基因分析柠檬类好像是最杂合程度最小的分类单元。 如同功酶， RAPD， SSR标记法所示。 四种甜橘子的分析显示所有的基因同样的标记，三种酸橙类的代表和三种葡萄柚也是。在接下来的研究中，次级代谢产物仅有一个个体参加。基因多样性的机体组成显示相邻系统树以所有 RFLP标记波带的有无的片段的不同指标为基础。区分出八个不同的标记。主要的线束被识别；第一个组是中国柑橘和甜橘，第二文旦和葡萄柚，第三柠檬和酸的柑橘属的多数。两种柠檬接近酸柑橘属的线束而三种酸橘子接近橘子或甜橙的线束。以 RFLP标记为基础的遗传多样性的机体组成获得类胡
