1、 PDF外文：http:/ 外文资料翻译译文 ： 在酪干乳杆菌 BL23 的 LDH 基因分析：乳酸生产上的作用 Juan Rico Mara Jess Yebra Gaspar Prez-Martnez Josef Deutscher Vicente Monedero 收稿日期： 2007 年 12 月 21 日 /接受日期： 2008 年 1 月 13 日 /发表时间： 2008 年1 月 30 日 学会工业微生物 2008 摘要： 干酪乳杆菌是一种通过通过 L-乳酸脱氢酶（ LDH1）的作用促使糖发酵主
2、要生产L-乳酸的乳酸菌。此外， D-乳 酸的异构体的少量产生一个 D-hydroxycaproate 脱氢酶（ HicD）的活动。 LDH1 是主要的 L-乳酸生产酶，但突变它的基因并没有消除 L-乳酸的合成。一项称作 “干酪乳杆菌基本法第二十三条草案的基因组序列”的调查揭示了相关的另外三个基因编码乳酸脱氢酶旁系。为了研究这些基因对全球的这种微生物的贡献，个体乳酸以及双突变体（ LDH1 LDH2， LDH1 LDH3， LDH1， LDH4 和 LDH1hicD）的生产，构建了乳酸生产的上清培养评估。 LDH2， LDH3 和 LDH4 基因乳酸生产中发挥的作用不大，
3、因为他们的 单一突变或在组合与 LDH1 缺失突变对 L-乳酸合成的影响很小。 LDH1突变体显示 D-乳酸产量增加，这是可能通过活动 HicD合成，因为它是在取消 LDH1 hicD 的双突变。相反，可能是 HicD，在没有 LDH1， LDH2， LDH3 或 LDH4 活动的情况下通过酶谱分析检测。此外，这些检测发现存在额外的频段表现出 D-/L-lactate 脱氢酶活性，这不能归咎于任何所描述的基因。这些结果表明， L-BL23 具有一个复杂的酶系统，能够减少乳酸丙酮酸。 关键词： 干酪乳杆菌、乳酸菌、 Hydroxycaproate 脱氢酶、乳酸 脱氢酶、代谢工程 &n
4、bsp;简介： 糖代谢乳酸菌（ LAB）的特点是通过乳酸脱氢酶的作用主要发酵生产乳酸产品，从而降低丙酮酸，乳酸。从生物技术的观点来看乳酸的生产是非常重要的，因为它可以产生许多自然发酵的实验室资源，它可以用在食品，制药和生物聚合物产业 7。在乳酸菌干酪 BL23，一些菌株已被广泛用于遗传，生理和生化研究，这两个基因编码的蛋白质乳酸脱氢酶活性已被描述 8， 12， 19。 LDH1 基因编码合成的 L-LDH，而 hicD 编码一个D-hydroxyisocaproate 提供了 D-乳酸脱氢酶。在这种细菌 19上与 突变株相关的 L-乳酸 和 D-乳酸的形成表明突变株已在
5、这两个基因上建成。然而，干酪乳杆菌 BL23 显示 LDH1突变体仍然产生大量的 L-乳酸 D-乳酸。一个与其他实验室删除 LDH 基因相似的行为也有报道。在这个意义上说，基因突变从植物乳杆菌的 L 型和 D 型上开始编码，使该生物体产生 50的 D 型跟 50 L 型的混合物，从来没有导致乳酸生产 3的完全缺失。 1 乳酸乳杆菌 sakei 的突变，在缺乏 D-乳酸脱氢酶活性酸菌的条件下，将导致具有强烈降低 L型和 D型的乳酸的菌株生产（ D异构体在消旋活动的作用下能够转换成 L Dlactate）但仍然产生少量的乳酸 15。最后乳酸菌的发酵在 ldhL 、 ldhD 双基因剔除
6、的情况下仍然能够合成乳酸 1。 EVorts 已作出建设在一个 aVected 或乳酸菌菌株上的几个的identiWed LDH 基因，因为它们可以用在通过非消旋，光发酵等途径生产活性乳酸 1。此外，代谢工程战略应用于 NADH 氧化再加上一个替代的丙酮酸的代谢，导致附加代谢产物的产生 4， 6， 13， 17。然而，已知的缺失乳酸脱氢酶基因的结合酶活性的表达并不总是能够降低丙酮酸 suYcient 改道对其他分子比如 signiWcant 丙酮酸 XOW 乳酸 diVerent的影响。由于这些原因，一个更好的涉及乳酸合成酶的研究将成为必要。在尝试探索的基因负责残留在干酪乳杆菌乳酸
7、生产 BL23 的 LDH1 突变体，我们探索其是否存在额外的LDH 基因突变以及在 eVects 乳酸生产上新发现的 LDHs 的基因组。 材料和方法： 菌株和生长条件： 在这项研究中干酪乳杆菌菌株的使用在表 1 中列出。他们生长在 MRS 培养基（ Oxoid公司）或 MRS 基本培养基中，每公升含：蛋白胨 10 克，肉类提取物 8 克，酵母提取物4 克，吐温 80， 1 毫升， K2HPO42 克 ；柠檬酸铵 2 克 ； MgSO4.7H2O， 0.2 克 ；MnSO4.4H2O， 0.05克，并辅以 0.2（ W / V）葡萄糖，在 37下静置。大肠
8、杆菌 DH5 是作为一个克隆宿主，在 LB 培养基中 37条件下搅拌生长，对于选择干酪乳杆菌的转化体，将 5 克 /毫升的红霉素加入培养基中。氨苄青霉素则用在 100 克 /毫升大肠杆菌中。 质粒和突变株的构建： pRV300 质粒 11用于兴建综合载体内部碎片的 L.casei， LDH2， LDH3， LDH4。一个519 bp 的片段从 LDH2 ampliWed PCR 结合寡核苷酸 5 -GATTCCCTACCTTACACG 和 5-TCTCAATGATGCCATAAGC 与 EcoRV 分为 pRV300 消化的克隆，给予 pRVldh2。一 505 bp的 LDH3 内部片段是与 5 -GTG ampliWed TTATTTCCGCGGTC 和 5 -GCTTAGCCTGATAAA 与SMAI 消化 TCTTC 和克隆到 pRV300 给 pRVldh3。 LDH4 的 437 bp 的片段， ampliWed 5
